担当区分：研究代表者 

配分額：18590000円 （ 直接経費：14300000円 、 間接経費：4290000円 ）

ヒトの腸内には約1000種類、100兆個以上の細菌が生息しており、腸内細菌叢と呼ばれている。腸内細菌叢の乱れに関連する疾患として偽膜性腸炎、難治性疾患である炎症性腸疾患などが報告されている。しかし、確立された治療法はまだない。そのため、生体内の細菌を特異的かつ持続的にコントロールする技術が求められている。申請者はこれまで細菌を特異的に殺菌できるシステムを探索してきた。その結果、RNA誘導型ヌクレアーゼが標的細菌を狙って特異的に殺菌できることを発見した。そこで本研究では、RNA誘導型ヌクレアーゼを細菌へ供給する遺伝子標的型治療薬の開発を企画した。

担当区分：研究分担者 

発展途上国では人が保菌する薬剤耐性菌が直接河川などに継続的に流出している。河川は薬剤耐性菌のリザーバーとなっていて、流入した薬剤耐性菌から耐性遺伝子がプラスミド等を介して他の様々な菌種に伝達されて、薬剤耐性遺伝子が拡散していると考えられている。この研究では、ワンヘルスの視点から人、環境、家畜などの分野で薬剤耐性菌・耐性遺伝子の拡散状況をゲノムの解析から明らかにする。さらに新たな抗菌薬開発も目指す。
感染症の治療に抗菌薬が使用されるようになり、それに伴って薬剤耐性菌が出現してきた。薬剤耐性菌は特に感染対策が不十分な状況で急速に拡散する。薬剤耐性遺伝子は染色体とは別のプラスミドに存在することが多く、人の体内や環境中で容易に菌種を超えて別の菌に伝達される。薬剤耐性遺伝子は環境細菌の中で増幅と変異を繰り返し、より高度耐性のものが人の病原細菌に伝達される循環サイクルが存在することが推測される。発展途上国では抗菌薬の適正使用や感染対策が十分できていないため、薬剤耐性菌の状況はさらに深刻である。また下水処理が十分でないため、病院や家庭、その他家畜農場等から薬剤耐性菌を含む排水が直接河川に排出されている。カンボジアでは患者から分離される薬剤耐性菌のゲノムに関する情報は限られており、河川や下水に関しては薬剤耐性菌に関する研究はほとんどない。この課題でこれまで、カンボジアにおいて人ならびに環境（河川）における薬剤耐性菌・薬剤耐性遺伝子の実態をゲノムの解析から明らかにし、耐性遺伝子の拡散のダイナミクスを追究してきた。カンボジア国立公衆衛生研究所と共同で、カンボジア国内の河川から広域セファロスポリンに耐性を示す薬剤耐性菌を収集し、日本に輸送して菌種を同定するとともに、薬剤感受性試験を行い、薬剤耐性菌のゲノムの解析を行った。人と河川でどのような薬剤耐性菌がどのような種類の耐性遺伝子・プラスミドを保有して拡散しているのかを明らかにし、さらに薬剤耐性遺伝子のリザーバーとしての河川の役割を追究してきた。
カンボジアNIPHと共同で、カンボジア国内の河川から、第三世代セファロスポリンに耐性を示すグラム陰性菌を培養した。河川については、比較的大きな河を選定し、下水については地理条件を調べて病院排水、家庭排水などが流入している川を選定し、雨季の９月と乾季の１２月に水を採取して細菌の培養を行なった。トータルで１８２株のグラム陰性細菌を収集した。菌株は全て名古屋大学に輸送した。これまでに同定を行い、Stenotrophomonas maltophilia２２株を除外し、１６０株を保存した。これらのゲノムDNAを抽出して、現在イルミナシーケンスによるゲノムの解析を進めている。予定通りに進展している。
収集した菌株のシーケンスデータを解析して、薬剤耐性遺伝子を同定する。耐性遺伝子は近年特に拡散しているblaNDM、blaKPCなどカルバペネム耐性遺伝子、blaCTX-Mなどの広域セファロスポリン耐性遺伝子、mcrなどのコリスチン耐性遺伝子、その他tet(X)、tmexCD-toprJなどのチゲサイクリン耐性遺伝子を標的とする。また、我々独自のライブラリを用いて薬剤耐性遺伝子とプラスミドの検出、ならびに型別を行う。イルミナシークエンスで解析した菌株のうち、代表的な株を数株選出して、ロングリードシーケンスを行って完全ゲノムデータを得る。遺伝子型(ST)、プラスミドのレプリコンタイプ、薬剤耐性遺伝子、病原性に関わる遺伝子を同定する。薬剤耐性遺伝子とそのプラスミドについて、菌株同士やデータベースの既報の菌株のものと比較解析する。共存する他の遺伝子やmobile gene elements、プラスミドのレプリコンタイプ、Incタイプ、また遺伝子の並び順から、菌株同士の関係さらに人分野と河川の間での薬剤耐性遺伝子の拡散の動態を明らかにする。ゲノムのデータはデータベースに登録し、今後様々な研究のリファレンスデータとして活用できるようにする。

担当区分：研究代表者 

配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）

これまでピロリ菌感染による胃の炎症は、腸管に存在するパイエル板を介したピロリ菌の取り込みや、リポ多糖（LPS）による胃内のTLR4の活性化によることが報告されてきた。しかし、腸管のパイエル板を介した直接的ではない胃の炎症の活性化や、TLR4の活性化が弱いピロリ菌のLPSにより活性化する炎症発生の機序は不明な点が多く、混沌としているのが現状である。そこで、ピロリ菌のsRNAと胃で強力に発現しているTLR3に着目した。本研究を行うことで、がんや炎症において、RNAやTLR3といった、既存の治療薬とは全く異なるターゲットを発見することが期待される。
ピロリ菌の感染は、胃炎、胃潰瘍、胃がん、MALTリンパ腫などの消化器疾患の発症に関わっている。本研究を進めていくと、ピロリ菌の保有するsmall RNA (sRNA)のsRNA-XおよびsRNA-Zが胃炎発症に関与していることが見出された。さらにピロリ菌臨床分離株を用いた実験結果から、sRNA-Xの発現量と臨床所見が相関することを見つけた。以上の結果から、ピロリ菌による胃炎には、ピロリ菌の保有する病原性sRNAが寄与することが明らかになった。
ピロリ菌は世界人口の約半数が感染している大規模感染症であり、胃炎や胃がんなどの消化器疾患を引き起こすことが知られているが、胃炎発症メカニズムは不明な点が多い。しかし本研究を通じて、ピロリ菌が保有するsmall RNAが胃炎発症メカニズムに関与している可能性が示唆された。本研究で得られた新知見は、他の細菌感染症解析の道を拓くほか、創薬・ワクチン開発へとつながることが期待される。