2023/09/14 更新

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ヒノハラ クニヒコ
日野原 邦彦
HINOHARA Kunihiko
所属
大学院医学系研究科 特任准教授
職名
特任准教授

学位 1

  1. 博士(理学) ( 2009年3月   東京医科歯科大学 ) 

研究キーワード 8

  1. 腫瘍進化

  2. 合成致死

  3. エピジェネティクス

  4. がん多様性

  5. 腫瘍進化

  6. 合成致死

  7. エピジェネティクス

  8. がん多様性

研究分野 4

  1. ライフサイエンス / 分子生物学

  2. ライフサイエンス / 腫瘍生物学

  3. ライフサイエンス / 分子生物学

  4. ライフサイエンス / 腫瘍生物学

経歴 6

  1. 名古屋大学   大学院医学系研究科分子細胞免疫学・高等研究院   特任准教授

    2019年7月 - 現在

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    国名:日本国

  2. 名古屋大学   高等研究院   特任准教授

    2019年7月 - 現在

  3. Dana-Farber Cancer Institute   Medical Oncology   Research fellow

    2014年4月 - 2019年6月

  4. 東京大学   医科学研究所・分子療法分野   特任助教

    2012年4月 - 2014年3月

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    国名:日本国

  5. 東京大学   医科学研究所・システム生命技術開発共同研究ユニット   特任助教

    2010年4月 - 2012年3月

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    国名:日本国

  6. 東京大学   医科学研究所・システム生命技術開発共同研究ユニット   ポスドク

    2009年4月 - 2010年3月

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    国名:日本国

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学歴 2

  1. 東京医科歯科大学   生命情報科学教育部

    2006年4月 - 2009年3月

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    国名: 日本国

  2. 東京理科大学   理学部   応用化学科

    - 2004年3月

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    国名: 日本国

 

論文 17

  1. The cancer epigenome: Non-cell autonomous player in tumor immunity

    Kato Shinichiro, Maeda Yuka, Sugiyama Daisuke, Watanabe Keisuke, Nishikawa Hiroyoshi, Hinohara Kunihiko

    CANCER SCIENCE   114 巻 ( 3 ) 頁: 730 - 740   2023年3月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:Cancer Science  

    Dysregulation of the tumor-intrinsic epigenetic circuit is a key driver event for the development of cancer. Accumulating evidence suggests that epigenetic and/or genetic drivers stimulate intrinsic oncogenic pathways as well as extrinsic factors that modulate the immune system. These modulations indeed shape the tumor microenvironment (TME), allowing pro-oncogenic factors to become oncogenic, thereby contributing to cancer development and progression. Here we review the epigenetic dysregulation arising in cancer cells that disseminates throughout the TME and beyond. Recent CRISPR screening has elucidated key epigenetic drivers that play important roles in the proliferation of cancer cells (intrinsic) and inhibition of antitumor immunity (extrinsic), which lead to the development and progression of cancer. These epigenetic players can serve as promising targets for cancer therapy as a dual (two-in-one)-targeted approach. Considering the interplay between cancer and the immune system as a key determinant of immunotherapy, we discuss a novel lineage-tracing technology that enables longitudinal monitoring of cancer and immune phenotypic heterogeneity and fate paths during cancer development, progression, and therapeutic interventions.

    DOI: 10.1111/cas.15681

    Web of Science

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  2. CRISPR screens reveal genetic determinants of PARP inhibitor sensitivity and resistance in prostate cancer

    Tsujino Takuya, Takai Tomoaki, Hinohara Kunihiko, Gui Fu, Tsutsumi Takeshi, Bai Xiao, Miao Chenkui, Feng Chao, Gui Bin, Sztupinszki Zsofia, Simoneau Antoine, Xie Ning, Fazli Ladan, Dong Xuesen, Azuma Haruhito, Choudhury Atish D. D., Mouw Kent W. W., Szallasi Zoltan, Zou Lee, Kibel Adam S. S., Jia Li

    NATURE COMMUNICATIONS   14 巻 ( 1 ) 頁: 252   2023年1月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:Nature Communications  

    Prostate cancer harboring BRCA1/2 mutations are often exceptionally sensitive to PARP inhibitors. However, genomic alterations in other DNA damage response genes have not been consistently predictive of clinical response to PARP inhibition. Here, we perform genome-wide CRISPR-Cas9 knockout screens in BRCA1/2-proficient prostate cancer cells and identify previously unknown genes whose loss has a profound impact on PARP inhibitor response. Specifically, MMS22L deletion, frequently observed (up to 14%) in prostate cancer, renders cells hypersensitive to PARP inhibitors by disrupting RAD51 loading required for homologous recombination repair, although this response is TP53-dependent. Unexpectedly, loss of CHEK2 confers resistance rather than sensitivity to PARP inhibition through increased expression of BRCA2, a target of CHEK2-TP53-E2F7-mediated transcriptional repression. Combined PARP and ATR inhibition overcomes PARP inhibitor resistance caused by CHEK2 loss. Our findings may inform the use of PARP inhibitors beyond BRCA1/2-deficient tumors and support reevaluation of current biomarkers for PARP inhibition in prostate cancer.

    DOI: 10.1038/s41467-023-35880-y

    Web of Science

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  3. [Cancer Phenotypic Plasticity and Therapeutic Resistance].

    Hinohara K

    Gan to kagaku ryoho. Cancer & chemotherapy   50 巻 ( 1 ) 頁: 7 - 12   2023年1月

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    記述言語:日本語  

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  4. A bifurcation concept for B-lymphoid/plasmacytoid dendritic cells with largely fluctuating transcriptome dynamics

    Nagaharu Keiki, Kojima Yasuhiro, Hirose Haruka, Minoura Kodai, Hinohara Kunihiko, Minami Hirohito, Kageyama Yuki, Sugimoto Yuka, Masuya Masahiro, Nii Shigeru, Seki Masahide, Suzuki Yutaka, Tawara Isao, Shimamura Teppei, Katayama Naoyuki, Nishikawa Hiroyoshi, Ohishi Kohshi

    CELL REPORTS   40 巻 ( 9 ) 頁: 111260   2022年8月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:Cell Reports  

    Hematopoiesis was considered a hierarchical stepwise process but was revised to a continuous process following single-cell RNA sequencing. However, the uncertainty or fluctuation of single-cell transcriptome dynamics during differentiation was not considered, and the dendritic cell (DC) pathway in the lymphoid context remains unclear. Here, we identify human B-plasmacytoid DC (pDC) bifurcation as large fluctuating transcriptome dynamics in the putative B/NK progenitor region by dry and wet methods. By converting splicing kinetics into diffusion dynamics in a deep generative model, our original computational methodology reveals strong fluctuation at B/pDC bifurcation in IL-7Rα+ regions, and LFA-1 fluctuates positively in the pDC direction at the bifurcation. These expectancies are validated by the presence of B/pDC progenitors in the IL-7Rα+ fraction and preferential expression of LFA-1 in pDC-biased progenitors with a niche-like culture system. We provide a model of fluctuation-based differentiation, which reconciles continuous and discrete models and is applicable to other developmental systems.

    DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111260

    Web of Science

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  5. Cancer immunotherapy with PI3K and PD-1 dual-blockade via optimal modulation of T cell activation signal

    Isoyama Sho, Mori Shigeyuki, Sugiyama Daisuke, Kojima Yasuhiro, Tada Yasuko, Shitara Kohei, Hinohara Kunihiko, Dan Shingo, Nishikawa Hiroyoshi

    JOURNAL FOR IMMUNOTHERAPY OF CANCER   9 巻 ( 8 )   2021年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:Journal for ImmunoTherapy of Cancer  

    Background Immune checkpoint blockade (ICB) induces durable clinical responses in patients with various types of cancer. However, its limited clinical efficacy requires the development of better approaches. In addition to immune checkpoint molecules, tumor-infiltrating immunosuppressive cells including regulatory T cells (Tregs) play crucial roles in the immune suppressive tumor microenvironment. While phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibition as a Treg-targeted treatment has been implicated in animal models, its effects on human Tregs and on the potential impairment of effector T cells are required to be clarified for successful cancer immunotherapy. Methods The impact of a selective-PI3K inhibitor ZSTK474 with or without anti-programmed cell death 1 (PD-1) monoclonal antibody on Tregs and CD8 + T cells were examined with in vivo animal models and in vitro experiments with antigen specific and non-specific fashions using peripheral blood from healthy individuals and cancer patients. Phenotypes and functions of Tregs and effector T cells were examined with comprehensive gene and protein expression assays. Results Improved antitumor effects by the PI3K inhibitor in combination with ICB, particularly PD-1 blockade, were observed in mice and humans. Although administration of the PI3K inhibitor at higher doses impaired activation of CD8 + T cells as well as Tregs, the optimization (doses and timing) of this combination treatment selectively decreased intratumoral Tregs, resulting in increased tumor antigen-specific CD8 + T cells in the treated mice. Moreover, on the administration of the PI3K inhibitor with the optimal dose for selectively deleting Tregs, PI3K signaling was inhibited not only in Tregs but also in activated CD8 + T cells, leading to the enhanced generation of tumor antigen-specific memory CD8 + T cells which contributed to durable antitumor immunity. These opposing outcomes between Tregs and CD8 + T cells were attributed to the high degree of dependence on T cell signaling in the former but not in the latter. Conclusions PI3K inhibitor in the combination with ICB with the optimized protocol fine-tuned T cell activation signaling for antitumor immunity via decreasing Tregs and optimizing memory CD8 + T cell responses, illustrating a promising combination therapy.

    DOI: 10.1136/jitc-2020-002279

    Web of Science

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  6. Synthetic Lethal and Resistance Interactions with BET Bromodomain Inhibitors in Triple-Negative Breast Cancer.

    Shu S, Wu HJ, Ge JY, Zeid R, Harris IS, Jovanović B, Murphy K, Wang B, Qiu X, Endress JE, Reyes J, Lim K, Font-Tello A, Syamala S, Xiao T, Reddy Chilamakuri CS, Papachristou EK, D'Santos C, Anand J, Hinohara K, Li W, McDonald TO, Luoma A, Modiste RJ, Nguyen QD, Michel B, Cejas P, Kadoch C, Jaffe JD, Wucherpfennig KW, Qi J, Liu XS, Long H, Brown M, Carroll JS, Brugge JS, Bradner J, Michor F, Polyak K

    Molecular cell   78 巻 ( 6 ) 頁: 1096 - 1113.e8   2020年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1016/j.molcel.2020.04.027

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  7. Perturbed myoepithelial cell differentiation in BRCA mutation carriers and in ductal carcinoma in situ

    Ding Lina, Su Ying, Fassl Anne, Hinohara Kunihiko, Qiu Xintao, Harper Nicholas W., Huh Sung Jin, Bloushtain-Qimron Noga, Jovanovic Bojana, Ekram Muhammad, Zi Xiaoyuan, Hines William C., Aleckovic Masa, del Alcazar Carlos Gil, Caulfield Ryan J., Bonal Dennis M., Quang-De Nguyen, Merino Vanessa F., Choudhury Sibgat, Ethington Gabrielle, Panos Laura, Grant Michael, Herlihy William, Au Alfred, Rosson Gedge D., Argani Pedram, Richardson Andrea L., Dillon Deborah, Allred D. Craig, Babski Kirsten, Kim Elizabeth Min Hui, McDonnell Charles H. III, Wagner Jon, Rowberry Ron, Bobolis Kristie, Kleer Celina G., Hwang E. Shelley, Blum Joanne L., Cristea Simona, Sicinski Piotr, Fan Rong, Long Henry W., Sukumar Saraswati, Park So Yeon, Garber Judy E., Bissell Mina, Yao Jun, Polyak Kornelia

    NATURE COMMUNICATIONS   10 巻 ( 1 ) 頁: 4182   2019年9月

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    記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Nature Communications  

    Myoepithelial cells play key roles in normal mammary gland development and in limiting pre-invasive to invasive breast tumor progression, yet their differentiation and perturbation in ductal carcinoma in situ (DCIS) are poorly understood. Here, we investigated myoepithelial cells in normal breast tissues of BRCA1 and BRCA2 germline mutation carriers and in non-carrier controls, and in sporadic DCIS. We found that in the normal breast of non-carriers, myoepithelial cells frequently co-express the p63 and TCF7 transcription factors and that p63 and TCF7 show overlapping chromatin peaks associated with differentiated myoepithelium-specific genes. In contrast, in normal breast tissues of BRCA1 mutation carriers the frequency of p63+TCF7+ myoepithelial cells is significantly decreased and p63 and TCF7 chromatin peaks do not overlap. These myoepithelial perturbations in normal breast tissues of BRCA1 germline mutation carriers may play a role in their higher risk of breast cancer. The fraction of p63+TCF7+ myoepithelial cells is also significantly decreased in DCIS, which may be associated with invasive progression.

    DOI: 10.1038/s41467-019-12125-5

    Web of Science

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  8. MRTF-A regulates proliferation and survival properties of pro-atherogenic macrophages.

    An J, Naruse TK, Hinohara K, Soejima Y, Sawabe M, Nakagawa Y, Kuwahara K, Kimura A

    Journal of molecular and cellular cardiology   133 巻   頁: 26-35 - 35   2019年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1016/j.yjmcc.2019.05.015

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  9. Intratumoral Heterogeneity: More Than Just Mutations.

    Hinohara K, Polyak K

    Trends in cell biology   29 巻 ( 7 ) 頁: 569-579 - 579   2019年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1016/j.tcb.2019.03.003

    PubMed

  10. MUC1-C Integrates Chromatin Remodeling and PARP1 Activity in the DNA Damage Response of Triple-Negative Breast Cancer Cells.

    Yamamoto M, Jin C, Hata T, Yasumizu Y, Zhang Y, Hong D, Maeda T, Miyo M, Hiraki M, Suzuki Y, Hinohara K, Rajabi H, Kufe D

    Cancer research   79 巻 ( 8 ) 頁: 2031-2041 - 2041   2019年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3259

    Web of Science

    PubMed

  11. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment.

    Ding L, Shunkwiler LB, Harper NW, Zhao Y, Hinohara K, Huh SJ, Ekram MB, Guz J, Kern MJ, Awgulewitsch A, Shull JD, Smits BMG, Polyak K

    PLoS genetics   15 巻 ( 3 ) 頁: e1008002   2019年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1371/journal.pgen.1008002

    PubMed

  12. KDM5 Histone Demethylase Activity Links Cellular Transcriptomic Heterogeneity to Therapeutic Resistance.

    Hinohara K, Wu HJ, Sébastien Vigneau, McDonald TO, Igarashi KJ, Yamamoto KN, Madsen T, Fassl A, Egri SB, Papanastasiou M, Ding L, Peluffo G, Cohen O, Kales SC, Lal-Nag M, Rai G, Maloney DJ, Jadhav A, Simeonov A, Wagle N, Brown M, Meissner A, Sicinski P, Jaffe JD, Jeselsohn R, Gimelbrant AA, Michor F, Polyak K

    Cancer cell   35 巻 ( 2 ) 頁: 330-332 - 332   2019年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1016/j.ccell.2019.01.012

    PubMed

  13. KDM5 Histone Demethylase Activity Links Cellular Transcriptomic Heterogeneity to Therapeutic Resistance.

    Hinohara K, Wu HJ, Vigneau S, McDonald TO, Igarashi KJ, Yamamoto KN, Madsen T, Fassl A, Egri SB, Papanastasiou M, Ding L, Peluffo G, Cohen O, Kales SC, Lal-Nag M, Rai G, Maloney DJ, Jadhav A, Simeonov A, Wagle N, Brown M, Meissner A, Sicinski P, Jaffe JD, Jeselsohn R, Gimelbrant AA, Michor F, Polyak K

    Cancer cell   34 巻 ( 6 ) 頁: 939-953.e9 - 953.e9   2018年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1016/j.ccell.2018.10.014

    PubMed

  14. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.

    Ben-David U, Siranosian B, Ha G, Tang H, Oren Y, Hinohara K, Strathdee CA, Dempster J, Lyons NJ, Burns R, Nag A, Kugener G, Cimini B, Tsvetkov P, Maruvka YE, O'Rourke R, Garrity A, Tubelli AA, Bandopadhayay P, Tsherniak A, Vazquez F, Wong B, Birger C, Ghandi M, Thorner AR, Bittker JA, Meyerson M, Getz G, Beroukhim R, Golub TR

    Nature   560 巻 ( 7718 ) 頁: 325-330 - 330   2018年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1038/s41586-018-0409-3

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  15. ATR inhibition controls aggressive prostate tumors deficient in Y-linked histone demethylase KDM5D 国際誌

    Komura Kazumasa, Yoshikawa Yuki, Shimamura Teppei, Chakraborty Goutam, Gerke Travis A., Hinohara Kunihiko, Chadalavada Kalyani, Jeong Seong Ho, Armenia Joshua, Du Shin-Yi, Mazzu Ying Z., Taniguchi Kohei, Ibuki Naokazu, Meyer Clifford A., Nanjangud Gouri J., Inamoto Teruo, Lee Gwo-Shu Mary, Mucci Lorelei A., Azuma Haruhito, Sweeney Christopher J., Kantoff Philip W.

    JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION   128 巻 ( 7 ) 頁: 2979 - 2995   2018年7月

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    記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Journal of Clinical Investigation  

    Epigenetic modifications control cancer development and clonal evolution in various cancer types. Here, we show that loss of the male-specific histone demethylase lysine-specific demethylase 5D (KDM5D) encoded on the Y chromosome epigenetically modifies histone methylation marks and alters gene expression, resulting in aggressive prostate cancer. Fluorescent in situ hybridization demonstrated that segmental or total deletion of the Y chromosome in prostate cancer cells is one of the causes of decreased KDM5D mRNA expression. The result of ChIP-sequencing analysis revealed that KDM5D preferably binds to promoter regions with coenrichment of the motifs of crucial transcription factors that regulate the cell cycle. Loss of KDM5D expression with dysregulated H3K4me3 transcriptional marks was associated with acceleration of the cell cycle and mitotic entry, leading to increased DNA-replication stress. Analysis of multiple clinical data sets reproducibly showed that loss of expression of KDM5D confers a poorer prognosis. Notably, we also found stress-induced DNA damage on the serine/threonine protein kinase ATR with loss of KDM5D. In KDM5D-deficient cells, blocking ATR activity with an ATR inhibitor enhanced DNA damage, which led to subsequent apoptosis. These data start to elucidate the biological characteristics resulting from loss of KDM5D and also provide clues for a potential novel therapeutic approach for this subset of aggressive prostate cancer.

    DOI: 10.1172/JCI96769

    Web of Science

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  16. ER Stress Signaling Promotes the Survival of Cancer "Persister Cells" Tolerant to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors 国際誌

    Terai Hideki, Kitajima Shunsuke, Potter Danielle S., Matsui Yusuke, Quiceno Laura Gutierrez, Chen Ting, Kim Tae-jung, Rusan Maria, Thai Tran C., Piccioni Federica, Donovan Katherine A., Kwiatkowski Nicholas, Hinohara Kunihiko, Wei Guo, Gray Nathanael S., Fischer Eric S., Wong Kwok-Kin, Shimamura Teppei, Letai Anthony, Hammerman Peter S., Barbie David A.

    CANCER RESEARCH   78 巻 ( 4 ) 頁: 1044 - 1057   2018年2月

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    記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Cancer Research  

    An increasingly recognized component of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) involves persistence of a drug-tolerant subpopulation of cancer cells that survive despite effective eradication of the majority of the cell population. Multiple groups have demonstrated that these drug-tolerant persister cells undergo transcriptional adaptation via an epigenetic state change that promotes cell survival. Because this mode of TKI drug tolerance appears to involve transcriptional addiction to specific genes and pathways, we hypothesized that systematic functional screening of EGFR TKI/transcriptional inhibitor combination therapy would yield important mechanistic insights and alternative drug escape pathways. We therefore performed a genome-wide CRISPR/Cas9 enhancer/suppressor screen in EGFR-dependent lung cancer PC9 cells treated with erlotinib þ THZ1 (CDK7/12 inhibitor) combination therapy, a combination previously shown to suppress drug-tolerant cells in this setting. As expected, suppression of multiple genes associated with transcriptional complexes (EP300, CREBBP, and MED1) enhanced erlotinib/THZ1 synergy. Unexpectedly, we uncovered nearly every component of the recently described ufmylation pathway in the synergy suppressor group. Loss of ufmylation did not affect canonical downstream EGFR signaling. Instead, absence of this pathway triggered a protective unfolded protein response associated with STING upregulation, promoting protumorigenic inflammatory signaling but also unique dependence on Bcl-xL. These data reveal that dysregulation of ufmylation and ER stress comprise a previously unrecognized TKI drug tolerance pathway that engages survival signaling, with potentially important therapeutic implications.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1904

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  17. MUC1-C Induces PD-L1 and Immune Evasion in Triple-Negative Breast Cancer.

    Maeda T, Hiraki M, Jin C, Rajabi H, Tagde A, Alam M, Bouillez A, Hu X, Suzuki Y, Miyo M, Hata T, Hinohara K, Kufe D

    Cancer research   78 巻 ( 1 ) 頁: 205-215 - 215   2018年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1636

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共同研究・競争的資金等の研究課題 1

  1. SWI/SNF変異陽性乳がんに対する新規合成致死療法の開発

    2019年8月 - 2021年3月

    次世代がん医療創生研究事業 

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    資金種別:競争的資金

科研費 7

  1. がん免疫療法における耐性化機序と進化軌跡の解明

    研究課題/研究課題番号:22K18381  2022年6月 - 2025年3月

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(開拓)

    日野原 邦彦

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    担当区分:研究代表者 

    配分額:26000000円 ( 直接経費:20000000円 、 間接経費:6000000円 )

    本研究では、1つの細胞を転写ランドスケープレベルで追跡可能な発現型バーコード技術を利用し、ACTに対する固形がんの耐性化過程を追跡する。ACT過程における個々のがん細胞の運命を発現型バーコード情報から1細胞レベルで空間的に明らかにし、ACTに対する耐性進化軌跡の時空間的な理解を図る。多様性を示す個々のがん細胞の免疫応答に関する機能的な境界を高解像度で解明することに挑戦し、ACT耐性細胞の発生起源とその維持に関わる制御機構を突き止めることを目指す。

  2. エピゲノムダイナミクスに基づくがん多様性の新たな理解

    研究課題/研究課題番号:20KK0184  2020年10月 - 2023年3月

    科学研究費助成事業  国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

    日野原 邦彦, 小嶋 泰弘, 加藤 真一郎

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    担当区分:研究代表者  資金種別:競争的資金

    配分額:18720000円 ( 直接経費:14400000円 、 間接経費:4320000円 )

    本研究課題では、クロマチン制御因子SWI/SNF複合体の遺伝子変異によって生じるエピジェネティクス制御機構の破綻が、発がん、治療耐性、再発といった悪性形質獲得に至る過程においてどのようにがん細胞の多様性を造出し、悪性化進展基盤を成すのかを1細胞エピゲノム解析技術によって解き明かす。1細胞エピゲノム情報を取り入れた統合解析を推進することにより、遺伝的要因とは異なるエピゲノム制御の側面からがん多様性の新たな理解を試み、エピゲノムのダイナミクスから生み出されるがんの不均一性を制御する革新的方法論の創出を目指す。
    本年度は、海外共同研究者より提供されたARID2欠失変異を持つタキサン系抗がん剤耐性乳がん細胞株を用いて、ARID2への分子的介入(野生型ARID2導入)前後の解析を進めた。バルク細胞集団を用いたChIP-seq解析を行い、野生型ARID2のゲノム結合領域をグローバルに明らかにするとともに、これらの結合領域がARID2変異陽性の薬剤耐性細胞では変化していることを見出した。並行して、バルクレベルでのRNA-seqデータとの統合解析も進め、ARID2の変化に応じたトランスクリプトームの変動とエピゲノム動態との関連性を見出しつつある。さらに、海外共同研究者の技術支援のもと、ARID2への分子的介入前後における1細胞単位のエピゲノムとトランスクリプトームの情報を、1細胞ATAC-seq及び1細胞RNA-seqにより取得した。現在、海外共同研究者と連携してこれらのデータ解析を進めているが、初期解析からはARID2のon/offによってエピゲノム・トランスクリプトームともに変化を起こすことを見出しているため、今後より詳細なクラスターレベルでの解析を進めていく予定である。一方、ARID2野生型メラノーマ(悪性黒色腫)細胞株の解析からは、ARID2の欠損により黒色調を呈する細胞から白色調の無色素性細胞へと劇的に変化することを見出した。この変化はメラノーマ細胞から産出されるメラニン色素の量的変化を意味するものであるが、今後この変化がメラノーマ悪性化の観点からどのような意義を持つのかについて検証を進めていく予定である。
    当初の計画に沿って、海外共同研究機関の技術指導のもと、ARID2のレスキュー細胞株モデルを用いた1細胞およびバルクレベルのエピゲノム・トランスクリプトーム解析を実施することができた。初期解析からはARID2のon/offによるこれらの表現型の変化が見てとれたため、来年度以降、1細胞RNA-seq・ATAC-seqのさらに詳細な解析を進めることで、トランスクリプトーム・エピゲノム変化の対応関係を明らかにするための実験データ準備が整ったと言える。また、メラノーマモデルにおいてもARID2レスキューモデル構築およびその解析に関して順調に成果が得られており、今後乳がんモデルとの類似性または差異を調べる環境を整えることができた。一方で、海外渡航制限により海外共同研究機関に赴くことができなかったことから、特に1細胞関連の実験を現地でのハンズオンで進めることができなかった。しかしながら、これらの状況を打破するためのオンラインハンズオントレーニングの体制を整えることができたことは当初予定していなかった成果であり、ポストコロナ時代における新たな海外との連携体制として今後も活用していきたいと考えている。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    今後は、上記にて取得した乳がんの1細胞データを元に、それぞれのクラスター(細胞集団)構造を解明し、クラスターごとのエピゲノム状態とトランスクリプトームの対応関係を明らかにする。これにより、ARID2変異による新規クラスターの生成消失や、クラスターに属する細胞の量的・質的変化により引き起こされるエピゲノム・トランスクリプトームの多様性動態を捉えることを目指す。以上より、ARID2の変化がいかにしてエピゲノムのダイナミクスを規定しているかを理解し、これらの変化が多くの乳がん患者における抗がん剤耐性化の過程で発生するメカニズムに迫りたい。また、これらの乳がん細胞における知見をメラノーマにおいても検証することで、異なるコンテクストにおけるARID2の機能的意義を紐解く。加えて、ARID2欠損による黒色調から白色調へのメラノーマ細胞の色素変化を規定する分子機構を解明するため、色素産生能に関わることが予想されるメラノーマのマスター転写因子MITFのゲノム結合領域をARID2 on/offの条件下にて比較検討する。以上のアプローチによって、ARID2を起点として誘発される各悪性形質がどのようなメカニズムを介して誘導されているのかについて異なる角度から包括的に解明する。
    データ解析については、海外共同研究者によるオンラインハンズオンでの指導体系を構築しているため、リモートで包括的解析手法を学ぶことで研究を推進する。昨今のコロナ禍の事情を鑑み、海外共同研究機関への訪問が実現可能となれば現地にて実験を進めていく予定だが、海外渡航が制限されている状況が長引く場合には、海外機関との連携をオンラインにて密に行い、海外研究者の指導のもと実験と解析を予定通り推進していくことを計画している。

  3. 1細胞バーコード法によるがん免疫逃避機構の解明

    研究課題/研究課題番号:20K21542  2020年7月 - 2022年3月

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(萌芽)

    日野原 邦彦

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    担当区分:研究代表者  資金種別:競争的資金

    配分額:6500000円 ( 直接経費:5000000円 、 間接経費:1500000円 )

    免疫系は自己・非自己を識別し、微生物などの非自己を排除するだけでなく、生体の恒常性を保つ上で極めて重要な役割を担っている。近年がん免疫療法が実用化されたことは記憶に新しいが、がんの組織は遺伝的・形質的に異なる多様ながん細胞により構成されているため、治療に対して抵抗性を示すクローンが生き残ってしまうことが課題となっている。このようながんの薬剤耐性化機序は、ダーウィン進化論的に突然変異と自然淘汰を経た適者生存として捉えることができる。本研究では、1細胞をバーコードによりラベルしてその進化軌跡を追跡する技術を応用し、個々のがん細胞が細胞傷害性T細胞からどのように逃れて増殖するに至るかを解明する。
    近年、患者組織中のがん細胞は非常に多様性に富むことがわかってきており、この多様性こそが薬剤耐性発生の根幹であると考えられている。本研究では、養子免疫療法に対する耐性化機構の解析を進め、先天的にがん組織中にレアな頻度で存在する耐性細胞と、元々は薬剤感受性であったがん細胞も後天的に耐性を獲得し得るという二つの異なるメカニズムによって治療抵抗性がもたらされることを明らかにした。さらに、個々のがん細胞をバーコード化して1個の細胞レベルで追跡可能な実験系を構築した。今後、薬剤耐性の獲得過程におけるバーコードの種類や数の変化を解析することで、免疫治療に対する薬剤耐性化メカニズムの新たな理解を試みたい。
    治療抵抗性の獲得メカニズムに異なるパターンが存在するということは、それぞれのメカニズムに対して異なる治療アプローチが必要であることを意味している。例えば養子免疫療法に加えて、先天的耐性細胞を狙い撃ちする薬剤と後天的耐性獲得を抑制する薬剤の3者をコンビネーションで投与する治療法などが効果的であることを示している。今後これらの耐性細胞の特徴を明らかにし、効果的な治療薬の開発へと結びつけたい。

  4. がん免疫療法への応用を目指したがん細胞特異的なSTINGアゴニスト輸送体の同定

    研究課題/研究課題番号:20K21553  2020年7月 - 2022年3月

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(萌芽)

    北嶋 俊輔, 日野原 邦彦

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    担当区分:研究分担者  資金種別:競争的資金

    細胞質内二本鎖DNAセンサーSTING経路を刺激するSTINGアゴニストは、がん細胞や免疫細胞に対して抗ウイルス応答を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。これまでに申請者は、STINGアゴニストの細胞内への取り込み様式ががん細胞と免疫細胞で大きく異なり、がん細胞では同じがん細胞株内であっても、STINGアゴニストの取り込みが単一細胞ごとに大きく異なることを明らかにした。そこで本研究では、STINGアゴニストに対する反応性の有無を基準とした単一細胞解析を行い、これまでに全く見つかっていない、がん細胞において機能的に発現するSTINGアゴニスト輸送体を同定することを目的とする。
    これまでに研究代表者は、がん細胞において細胞質内二本鎖DNAセンサーであるSTING経路が抑制されることにより、がん特異的抗原提示能の低下や腫瘍組織浸潤リンパ球の減少につながり、免疫チェックポイント阻害薬に対する治療抵抗性に寄与することを明らかにした。そこで、がん細胞自身を標的としたSTING経路活性化が、がん免疫療法抵抗性を克服するための治療戦略として有効であると考え、本研究では、これまでにほとんど明らかになっていない細胞内在性STINGアゴニスト2’3’cGAMP(以降cGAMP)の輸送体を同定することを目的とする。
    ① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析
    本年度は、主に単一細胞解析に使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の検討を詳細に行った。STING経路が抑制されていることが報告されている種々のヒト由来の肺がん細胞株、大腸がん細胞株、メラノーマ細胞株を用いて、細胞外にcGAMPを投与したところ、H1944やH2122、H647、A375株などのヒトがん細胞株において、cGAMP投与後3-6時間程度でSTING経路が活性化することを明らかにした。STING経路の活性化には細胞外に分泌されるSTING下流サイトカインCXCL10の濃度をELISAにより評価した。また細胞外に添加するcGAMPの濃度を検討し、投与条件の最適化を行った。
    ② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化
    単一の細胞を転写ランドスケープレベルで追跡するための実験系最適化を行った。発現バーコードライブラリを用いて、A375株を含む複数のがん細胞を一細胞レベルでラベルし、10x Genomics社の1細胞解析キットにてトランスクリプトーム情報とバーコード情報を同時取得するための実験系と解析系の構築を進めた。
    2020年度の研究実施計画は主に「① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析」および「② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化」であった。
    ①に関しては、これまでに研究代表者らやその他のグループから、肺がん細胞や大腸がん細胞、メラノーマ細胞などでSTING経路が抑制されることが報告されており、2020年度はこれら既報の細胞株を用いて、単一細胞解析を行うための細胞外cGAMP投与の最適化を行った。単一細胞間での感受性の差異を検出するため、CXCL10の発現上昇を指標として、短期間かつ低濃度で明確なSTING活性化が観察される条件を検討した。具体的には、細胞株ごとに多少の違いはあるものの、約5-10 mg/mlのcGAMPで3-6時間刺激を行うことが最適であると決定した。本年度は、最適化した条件を用いて、実際に単一細胞発現解析を実施する予定であるが、使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の最適化という2020年度の研究目標に関しては、おおむね順調に達成したと考えられる。
    ②に関しては、主に発現バーコードライブラリのウイルス感染条件最適化とバーコード化細胞の1細胞解析予備実験を行った。細胞ごとに異なるバーコードで標識するため、MOI0.1にてレンチウイルス感染を行い、その後GFPソートすることで複数のバーコード化細胞を樹立した。予備検討として10xによる1細胞解析を行い、データからトランスクリプトーム情報に加えてバーコード情報を取り出す解析手法の確立を進めている。以上より、1細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化という2020年度の研究目標に関して、おおむね順調に達成したと考えられる。
    ① バーコードライブラリーを用いた細胞標識:昨年度に投与条件の最適化を行ったヒトがん細胞株を用いて、RNA型発現バーコードあるいは必要に応じてDNA型バーコードにより標識する。発現バーコードライブラリレンチウイルスをMultiplicity of infection 0.1で感染させ、単一細胞ごとに1万種類の異なる発現バーコードで細胞を標識する。
    ② cGAMP処理前後での単一細胞レベルでの遺伝子発現変動解析:cGAMP未処理あるいは3時間処理したバーコード化済み細胞株からそれぞれRNAを回収した後、10xGenomicsを用いた単一細胞RNAシークエンスにより、バーコード情報と遺伝子発現プロファイルを同時に読み取る。10xGenomicsデータはパイプラインCell Rangerにて解析し、tSNEもしくはSPADEにより可視化することによって2’3’cGAMP処理前後による遺伝子発現変化を単一細胞レベルで捉える。
    ③ cGAMP輸送体候補遺伝子の抽出と機能解析:様々なSTING標的遺伝子を含むGene set「STING SIGNATUR」を用いて、cGAMP処理前後におけるエンリッチメントスコアの変動を計算し、単一細胞レベルでcGAMPに対する反応性の高低による順位付けを行う。次に、刺激前における発現量が反応性と正に相関する遺伝子群を抽出する。次に、CRISPR/Cas9系を用いて候補遺伝子の欠損細胞を作製し、細胞外cGAMPに対する反応性を検討する。STING活性化マーカーとしてCXCL10の分泌亢進をELISAにより測定する。コントロール実験として、トランスフェクションによるcGAMP導入を実施し、候補遺伝子が膜輸送体を介したcGAMP取り込み特異的に作用するか否かを検討する。

  5. 神経膠腫における腫瘍進化的トラジェクションの解明と次世代個別化医療の探索

    研究課題/研究課題番号:20H03789  2020年4月 - 2023年3月

    科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    夏目 敦至, 大岡 史治, 日野原 邦彦, 青木 恒介

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    担当区分:研究分担者  資金種別:競争的資金

    本課題では、これまでの組織レベルの研究ではわからなかった、腫瘍増殖を引き起こす進化遺伝子変異(evolutionary mutation)をシングルセルバーコード解析技術により探索し、腫瘍の寛解につながる治療法を見出すことを目的とする。IDH1変異やEZH2高発現に依存しなくなった進化的トラジェクションを引き起こす起因遺伝子を同定し、悪性転化により腫瘍増殖が制御不能になる前に介入できる新規薬剤を見出すことを最終的なゴールとする。本研究の科学的な裏付けをもって、悪性転化を阻止・遅延するというきめ細やかな治療戦略により、新規のプレシジョンメディシンの概念を確立する。

  6. 膠芽腫における合成致死性メカニズムの解明

    研究課題/研究課題番号:20H03512  2020年4月 - 2023年3月

    科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    日野原 邦彦

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    担当区分:研究代表者  資金種別:競争的資金

    配分額:17810000円 ( 直接経費:13700000円 、 間接経費:4110000円 )

    悪性脳腫瘍である膠芽腫に対する治療薬は現在のところアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)のみであり、そのTMZに対しても最終的に耐性が出現することから、その克服や新規治療法の開発が喫緊の課題である。本研究では、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングによりATRX変異陽性膠芽腫のアキレス腱を発見し、新規合成致死性メカニズムに基づいた新たな治療選択肢の創出を目指す。加えて、ATRX変異によるエピジェネティック変化が細胞のトランスクリプトーム多様性に影響し、それによって膠芽腫の進展や薬剤耐性が誘導されるという新たな仮説を検証する。
    本年度は、昨年度までに樹立した3つのドキシサイキリン誘導性ATRXノックアウト細胞株を用いて、ゲノムワイドCRISPR loss-of-functionスクリーニングを実施した。これらの細胞株を用いたスクリーニングは、ATRXノックアウト下のみならず、現在膠芽腫唯一の治療薬となっているアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)の投与下においても実施した。まずこれら3種の細胞株にCRISPR H3ライブラリを感染させ、十分にATRXノックアウトによる影響が出るように、ドキシサイクリン+/-およびTMZ+/-の条件下でそれぞれの細胞株を3週間培養した。その後DNA抽出を行い、CRISPRライブラリ部分をPCRにて増幅して次世代シークエンス解析を行なった。CRISPR解析用パイプラインであるMAGeCKFluteを用い、negative selectionから合成致死性遺伝子候補、positive selectionから治療抵抗性遺伝子候補の抽出を試み、ATRXノックアウトとTMZ投与下において合成致死性・治療抵抗性を示す因子をそれぞれ複数同定することに成功した。今後これら候補因子の個別ノックアウト株を樹立してスクリーニングのバリデーションを進めることで、新規合成致死性療法の開発と薬剤耐性メカニズムの解明につながる研究成果が得られることが期待される。一方、ATRXによるエピゲノム制御機構を明らかにするため、樹立したATRXノックアウト細胞株を用いてChIP-seq解析も行い、ATRX特異的なゲノム結合領域を明らかにした。また、TMZに対する薬剤耐性化過程の細胞進化軌跡の解明に向け、モデル細胞株を用いたバーコード技術の開発・最適化を進めた。
    昨年度に樹立したCas9安定発現株を用いたATRXノックアウトの系を応用し、Cas9をドキシサイクリン誘導性のiCas9へと変更して再度誘導性ノックアウト細胞株を3種類樹立することができたため、これらを対象としたゲノムワイドCRISPR loss-of-functionスクリーニングを実施した。また、当初計画には含めていなかった、TMZ投与下におけるスクリーニングも3種類全ての細胞株で並行して進めることができた。CRISPR解析用パイプラインであるMAGeCKFluteを用いたデータ解析も特段の問題なく順調に進んだ。スクリーニングのデータ解析結果からは、合成致死性・薬剤耐性に関わる候補因子群の両方で非常に興味深い遺伝子群が釣れてきており、来年度に実施予定の個別バリデーションの結果から有望な治療標的を発見することが期待できる。また、ATRXノックアウトの系を用いたChIP-seq解析から、ATRX特異的なゲノム結合領域とノックアウトによるその減弱が明らかとなったことから、RNA-seqおよびATAC-seqを追加実施してATRXによるエピゲノム制御機構を包括的に明らかにするための実験系を整えることができたと言える。また、TMZに対する薬剤耐性化過程における細胞の進化軌跡の解明研究に関するバーコード技術の準備は順調に進み、モデル細胞株を用いた予備検討からバーコードライブラリウイルスのクオリティと耐性化実験及び解析パイプラインがワークすることを確認できた。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    本年度に実施したゲノムワイドCRISPR loss-of-functionスクリーニングから得られた候補因子群には興味深い標的が複数含まれていたため、今後これら候補因子の個別ノックアウト株を樹立してスクリーニングのバリデーションを進めることで、ATRX変異陽性膠芽腫に対する新規合成致死性療法のシーズ同定へと歩を進める。また、TMZ投与後にenrichしたsgRNAsの解析を詳細に進めることで、TMZに対する新たな薬剤耐性化メカニズムの解明につながる研究成果を得ることを目指す。一方、本年度はATRXのグローバルなゲノム結合領域を明らかにすることができたことから、今後RNA-seqやATAC-seqとの統合解析を進め、ATRXのon/off条件下における遺伝子発現変動やクロマチンのオープン・クローズ状態を理解することで、ATRXによるエピゲノム制御機構を明らかにしていく。加えて、上記のCRISPRスクリーニングにて実施したTMZ投与の系を利用し、細胞バーコード化技術を用いた薬剤耐性化過程における進化軌跡の解明研究を進めていく予定である。バーコードによる細胞系譜追跡から薬剤耐性化メカニズムを1細胞レベルで解明し、CRISPRスクリーニングから得られる薬剤耐性化メカニズムと併せて統合的な理解を図ることで、TMZに対する薬剤耐性の根幹を成すバイオロジーを明らかにする。以上のような複数のアプローチを組み合わせることにより、ATRX変異陽性膠芽腫に対する新たな治療法の開発と、現在唯一の治療薬であるTMZに対する薬剤耐性化を克服する治療法の確立を目指す。

  7. SWI/SNF変異陽性乳がんに対する新規合成致死療法の開発

    2019年8月 - 2021年3月

    日本医療研究開発機構(AMED)  次世代がん医療創生研究事業 

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    資金種別:競争的資金

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