Country：Japan

Country：Japan

Country： Japan

Country： Japan

Grant type：Competitive

Authorship：Principal investigator 

Grant amount：\26000000 （ Direct Cost: \20000000 、 Indirect Cost：\6000000 ）

本研究では、１つの細胞を転写ランドスケープレベルで追跡可能な発現型バーコード技術を利用し、ACTに対する固形がんの耐性化過程を追跡する。ACT過程における個々のがん細胞の運命を発現型バーコード情報から1細胞レベルで空間的に明らかにし、ACTに対する耐性進化軌跡の時空間的な理解を図る。多様性を示す個々のがん細胞の免疫応答に関する機能的な境界を高解像度で解明することに挑戦し、ACT耐性細胞の発生起源とその維持に関わる制御機構を突き止めることを目指す。

Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\18720000 （ Direct Cost: \14400000 、 Indirect Cost：\4320000 ）

本研究課題では、クロマチン制御因子SWI/SNF複合体の遺伝子変異によって生じるエピジェネティクス制御機構の破綻が、発がん、治療耐性、再発といった悪性形質獲得に至る過程においてどのようにがん細胞の多様性を造出し、悪性化進展基盤を成すのかを１細胞エピゲノム解析技術によって解き明かす。１細胞エピゲノム情報を取り入れた統合解析を推進することにより、遺伝的要因とは異なるエピゲノム制御の側面からがん多様性の新たな理解を試み、エピゲノムのダイナミクスから生み出されるがんの不均一性を制御する革新的方法論の創出を目指す。
本年度は、海外共同研究機関からARID2変異陽性のメラノーマ細胞とタキサン系抗癌剤耐性乳がん細胞の提供を受け、これらの細胞株に対して野生型ARID2を導入した細胞実験モデルの構築を行った。本モデルを用いてARID2が実際に細胞増殖に関与するかを検証したところ、ARID2レスキューによってメラノーマ・薬剤耐性乳がん共に細胞増殖能が低下することを見出した。これらの知見はそれぞれのコンテクストにおけるARID2の重要性を示唆するものであった。加えて、ARID2野生型のメラノーマ細胞と薬剤感受性乳がん細胞を対象とし、CRISPR/Cas9を用いてARID2ノックアウト細胞株を樹立した。メラノーマでは発症初期に認められるARID2の機能欠失変異に一致してARID2のノックアウトによって細胞増殖能の亢進が認められたことに加え、メラノサイト細胞系譜特有の表現型であるメラニン産生が低下することを明らかにした。これらは、我々が想定した細胞系譜もしくは時期特異的なARID2変異の生物学的意義を間接的に示唆するものと考える。一方、薬剤感受性乳がん細胞ではARID2ノックアウトによる細胞増殖能の亢進・薬剤耐性化は認められなかったことから、進行再発乳がんに認められるARID2変異は薬剤耐性化のドライバー因子ではなく耐性化した細胞の増殖能に関わるものと考えられた。加えて、来年度に実施予定の１細胞解析に先立ち、これらのモデル細胞株のバルクRNA-seq解析を行い、ARID2のレスキューによって薬剤耐性乳がんの炎症応答パスウェイが変化することを明らかにした。海外共同研究機関とはウェブベースでのミーティングを随時オンラインにて行っており、本年度の研究成果をもとに来年度以降で海外共同研究者の保有する最先端エピゲノム研究の見地を取り入れた研究を展開していくための議論を進めている。
当初の計画に沿って、海外共同研究機関からARID2変異メラノーマ細胞とARID2変異薬剤耐性乳がん細胞の提供を受け、これらを対象とした野生型ARID2のレスキュー系を樹立した。SWI/SNF複合体を構成する因子群は、片側アレルの不活化変異に伴う遺伝子発現の量的な低下によって野生型表現型を失うこと（Haploinsufficiency）が知られており、我々の細胞株モデルも１アレルに不活化変異を有していることから、ドキシサイクリン誘導性に野生型ARID2を発現するレンチウイルスを１細胞につき１コピー導入が起こるように低タイターで感染させた。ARID2の1コピーレスキューによってメラノーマ・耐性乳がん共に細胞増殖能の低下が認められたことから、今後実施予定の１細胞解析を基軸としたマルチモーダル解析に供する細胞株モデルを確立できたと考えている。これらのレスキューモデルに対するコントロールとして、野生型ARID2を保有する複数の細胞株についてもARID2ノックアウト細胞株を樹立した。耐性乳がん細胞株におけるARID2レベルの変化がどのようにトランスクリプトームに影響するかについては、既にバルクレベルのRNA-seq解析を終えており、ARID２のレスキューによって炎症応答パスウェイが変化することを見出している。この結果は、作成したモデル細胞株においてARID２のレスキューがトランスクリプトームレベルで作用していることを示しており、来年度以降、１細胞RNA-seq・ATAC-seqを行うことで、バルクレベルと１細胞レベルでのトランスクリプトーム・エピゲノム変化の対応関係を明らかにするための準備が整ったと言える。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
ARID2の発現レベルにおける量的変化がいかにしてトランスクリプトームやエピゲノムといった細胞表現型の多様性に寄与し得るかを明らかにするには、ARID2の変化がどのような１細胞レベルの変化を引き起こすかについて１細胞RNA-seq・ATAC-seqによる解析を推進する必要がある。当初の予定では、１細胞エピゲノム解析のエキスパートである海外共同研究機関現地にてサポートを受けることでこれらの解析を実施していく予定としていたが、現状では新型コロナウイルスによるパンデミックの影響で海外への渡航が厳しく制限されている。そこで、研究の進捗への影響を最小限とするために、現在ウェブベースでリモートにて海外共同研究機関からハンズオントレーニングを受ける準備を進めている。１細胞解析装置等の実験設備は研究代表者の所属機関に配備済みであることから、リモートトレーニングによって技術的に習熟した後には迅速に１細胞解析の実施へと移行することが可能である。渡航制限が解除された際には海外共同研究機関に赴き、現地研究者との緊密な連携のもと実験と解析を推進していく予定としている。１細胞データの解析では、ARID2レスキューによってトランスクリプトームのクラスター（細胞集団）が新たに出現するかどうか、新規に出現したトランスクリプトームのクラスターがエピゲノムレベルでの新規のクラスター出現により実現されているのかを検証し、トランスクリプトーム多様性の背後に、エピゲノム変化による転写現象の確率的なゆらぎの増大があるのか、エピゲノム自体の多様化があるのかを明らかにしていく。これらの１細胞形質動態から、異なるがん病態・がん種にまたがるARID2変異の腫瘍生物学的な意義を見出す。

Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\6500000 （ Direct Cost: \5000000 、 Indirect Cost：\1500000 ）

免疫系は自己・非自己を識別し、微生物などの非自己を排除するだけでなく、生体の恒常性を保つ上で極めて重要な役割を担っている。近年がん免疫療法が実用化されたことは記憶に新しいが、がんの組織は遺伝的・形質的に異なる多様ながん細胞により構成されているため、治療に対して抵抗性を示すクローンが生き残ってしまうことが課題となっている。このようながんの薬剤耐性化機序は、ダーウィン進化論的に突然変異と自然淘汰を経た適者生存として捉えることができる。本研究では、1細胞をバーコードによりラベルしてその進化軌跡を追跡する技術を応用し、個々のがん細胞が細胞傷害性T細胞からどのように逃れて増殖するに至るかを解明する。
本年度は、マウスでのCTL耐性進化軌跡の解明に向けたがん細胞株移植モデルを確立した。具体的には、neoantigenとしてmERK2を持つマウス繊維肉腫の細胞株CMS5aとmERK2特異的なTCRを持つトランスジェニックマウスDUC18の組み合わせを対象とし、がん細胞側の多様性がどのように養子免疫療法（Adoptive T cell therapy : ACT）から逃れて耐性化するかを検討するための実験系を構築した。mERK2特異的なT細胞の移植によって一旦増殖抑制はかかるものの、全ての移植群で最終的には耐性化したがん細胞集団が再増殖してくることがわかった。エクソームシークエンス解析からは、耐性がんが完全にmERK2-negativeであることが同定され、腫瘍特異抗原の消失による免疫逃避機構が明らかとなった。GFPラベルした耐性細胞とDsRedラベルした感受性細胞の混合移植実験では、ACT後の腫瘍組織が全てGFP-positiveであったことから、治療後に増殖してくる集団はpre-existingかつgenetically distinctな耐性細胞由来であることが示唆された。しかしながら、感受性細胞集団をシングルセルクローン化して移植実験を行った結果、非常にレアな確率で耐性化するケースが認められたため、上記の先天的耐性化モデル以外に後天的な獲得耐性による薬剤耐性化機構も存在することがわかった。現在、個々のがん細胞をバーコードライブラリでラベルしたCMS5a細胞株の準備と移植実験系の構築を進めており、本実験モデルからバーコード情報によるFate Mappingを行うことでACTに対する耐性進化軌跡の統合的解明を目指す。
ACTに対する耐性化実験モデルとして、mERK2変異陽性のマウス繊維肉腫の細胞株CMS5aとmERK2特異的TCRを持つトランスジェニックマウスDUC18の組み合わせの実験系構築を終えた。エクソームシークエンスやシングルセルクローン解析によってCMS5aにおける耐性化メカニズムの検証を進め、薬剤耐性化は（１）mERK2変異を欠損したpre-existingな耐性細胞に由来し得ること、（２）後天的にも耐性化変異を獲得し得ることの両者によってもたらされることを見出した。感受性細胞のシングルセルクローンが一部後天的に耐性を獲得する機構が発見されたため、どのようなコンテクストにおいて獲得耐性化が起こるのかを検討し、ACTの開始タイミングがキーとなっていることを見出した。具体的には移植５日後にACTを開始すると全ての移植群で耐性化してこないのに対し、治療開始を遅らせるに従って耐性化の頻度が上昇し、移植17日後からACTを開始した群では全て耐性化した。これらの結果は、ACTに対する耐性化メカニズムの複雑性が高いこと、単純な移植実験モデルではその全容解明が困難であることを示すものであった。そこで当初の計画通り、現在一つひとつのCMS5a細胞を異なるバーコードでラベルして追跡する移植実験系の構築を進めている。バーコードライブラリウイルスの準備とその感染まで終えており、今後このバーコード化細胞を実際に移植してACT耐性化実験を進める予定である。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
１細胞ごとに異なるバーコードでラベルして進化軌跡を時間的に追跡することで、上記の異なる耐性化メカニズムがいつどのように発現してくるのかを明らかにしていく。バーコード化細胞の移植実験では、移植細胞数やACTの投与開始日等について上述の最適化した実験系を用いて解析を進める。耐性化に伴って増大する腫瘍組織を時系列にサンプリングし、次世代シークエンスにてバーコード情報を紐解く。これらの実験を複数のマウスレプリケイトを準備して実施し、レプリケイト間で同一バーコードが濃縮するのか異なるバーコードが同定されるのかを解析することで、それぞれpre-existingとacquired resistanceを判別する。本年度の進化軌跡解析からは、pre-existingな耐性獲得機構の主要因として遺伝子変異が示唆されているため、バーコード化細胞の耐性化モデルについても蛍光in situハイブリダイゼーションによる染色体解析やエクソームシークエンスによる遺伝子変異解析を行う。一方で、ACT開始日の遅延に従って感受性細胞クローンが耐性化する獲得機構に関しては不明瞭な部分が多いが、薬剤投与されるとエピジェネティック機構を利用して休眠状態となるパーシスター細胞の存在が示唆される場合は、ヒストンマススペクトロメトリーやクロマチン免疫沈降シークエンス等により解析を進め、どのようなエピジェネティック変化がパーシスター細胞集団を規定しているかを解明する。本研究の推進により、多様ながん細胞集団における個々の細胞のACT応答に関する機能的な境界が同定され、ACT耐性細胞の発生起源とその維持に関わる制御機構を突き止めることが可能となる。これにより、生物が本来的に有する多様性という概念に深く根ざした疾患であるがんの免疫応答メカニズムに対する理解が深まり、免疫療法の効果を飛躍的に高める突破口を切り開きたい。

Authorship：Coinvestigator(s)  Grant type：Competitive

細胞質内二本鎖DNAセンサーSTING経路を刺激するSTINGアゴニストは、がん細胞や免疫細胞に対して抗ウイルス応答を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。これまでに申請者は、STINGアゴニストの細胞内への取り込み様式ががん細胞と免疫細胞で大きく異なり、がん細胞では同じがん細胞株内であっても、STINGアゴニストの取り込みが単一細胞ごとに大きく異なることを明らかにした。そこで本研究では、STINGアゴニストに対する反応性の有無を基準とした単一細胞解析を行い、これまでに全く見つかっていない、がん細胞において機能的に発現するSTINGアゴニスト輸送体を同定することを目的とする。
これまでに研究代表者は、がん細胞において細胞質内二本鎖DNAセンサーであるSTING経路が抑制されることにより、がん特異的抗原提示能の低下や腫瘍組織浸潤リンパ球の減少につながり、免疫チェックポイント阻害薬に対する治療抵抗性に寄与することを明らかにした。そこで、がん細胞自身を標的としたSTING経路活性化が、がん免疫療法抵抗性を克服するための治療戦略として有効であると考え、本研究では、これまでにほとんど明らかになっていない細胞内在性STINGアゴニスト2’3’cGAMP（以降cGAMP）の輸送体を同定することを目的とする。
① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析
本年度は、主に単一細胞解析に使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の検討を詳細に行った。STING経路が抑制されていることが報告されている種々のヒト由来の肺がん細胞株、大腸がん細胞株、メラノーマ細胞株を用いて、細胞外にcGAMPを投与したところ、H1944やH2122、H647、A375株などのヒトがん細胞株において、cGAMP投与後３－６時間程度でSTING経路が活性化することを明らかにした。STING経路の活性化には細胞外に分泌されるSTING下流サイトカインCXCL10の濃度をELISAにより評価した。また細胞外に添加するcGAMPの濃度を検討し、投与条件の最適化を行った。
② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化
単一の細胞を転写ランドスケープレベルで追跡するための実験系最適化を行った。発現バーコードライブラリを用いて、A375株を含む複数のがん細胞を一細胞レベルでラベルし、10x Genomics社の１細胞解析キットにてトランスクリプトーム情報とバーコード情報を同時取得するための実験系と解析系の構築を進めた。
2020年度の研究実施計画は主に「① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析」および「② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化」であった。
①に関しては、これまでに研究代表者らやその他のグループから、肺がん細胞や大腸がん細胞、メラノーマ細胞などでSTING経路が抑制されることが報告されており、2020年度はこれら既報の細胞株を用いて、単一細胞解析を行うための細胞外cGAMP投与の最適化を行った。単一細胞間での感受性の差異を検出するため、CXCL10の発現上昇を指標として、短期間かつ低濃度で明確なSTING活性化が観察される条件を検討した。具体的には、細胞株ごとに多少の違いはあるものの、約5-10 mg/mlのcGAMPで3-6時間刺激を行うことが最適であると決定した。本年度は、最適化した条件を用いて、実際に単一細胞発現解析を実施する予定であるが、使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の最適化という2020年度の研究目標に関しては、おおむね順調に達成したと考えられる。
②に関しては、主に発現バーコードライブラリのウイルス感染条件最適化とバーコード化細胞の１細胞解析予備実験を行った。細胞ごとに異なるバーコードで標識するため、MOI0.1にてレンチウイルス感染を行い、その後GFPソートすることで複数のバーコード化細胞を樹立した。予備検討として10xによる１細胞解析を行い、データからトランスクリプトーム情報に加えてバーコード情報を取り出す解析手法の確立を進めている。以上より、１細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化という2020年度の研究目標に関して、おおむね順調に達成したと考えられる。
① バーコードライブラリーを用いた細胞標識：昨年度に投与条件の最適化を行ったヒトがん細胞株を用いて、RNA型発現バーコードあるいは必要に応じてDNA型バーコードにより標識する。発現バーコードライブラリレンチウイルスをMultiplicity of infection 0.1で感染させ、単一細胞ごとに1万種類の異なる発現バーコードで細胞を標識する。
② cGAMP処理前後での単一細胞レベルでの遺伝子発現変動解析：cGAMP未処理あるいは3時間処理したバーコード化済み細胞株からそれぞれRNAを回収した後、10xGenomicsを用いた単一細胞RNAシークエンスにより、バーコード情報と遺伝子発現プロファイルを同時に読み取る。10xGenomicsデータはパイプラインCell Rangerにて解析し、tSNEもしくはSPADEにより可視化することによって2’3’cGAMP処理前後による遺伝子発現変化を単一細胞レベルで捉える。
③ cGAMP輸送体候補遺伝子の抽出と機能解析：様々なSTING標的遺伝子を含むGene set「STING SIGNATUR」を用いて、cGAMP処理前後におけるエンリッチメントスコアの変動を計算し、単一細胞レベルでcGAMPに対する反応性の高低による順位付けを行う。次に、刺激前における発現量が反応性と正に相関する遺伝子群を抽出する。次に、CRISPR/Cas9系を用いて候補遺伝子の欠損細胞を作製し、細胞外cGAMPに対する反応性を検討する。STING活性化マーカーとしてCXCL10の分泌亢進をELISAにより測定する。コントロール実験として、トランスフェクションによるcGAMP導入を実施し、候補遺伝子が膜輸送体を介したcGAMP取り込み特異的に作用するか否かを検討する。

Authorship：Coinvestigator(s)  Grant type：Competitive