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HINOHARA Kunihiko
 
Organization
Graduate School of Medicine Program in Integrated Medicine Microbiology and Immunology Designated associate professor
Title
Designated associate professor

Degree 1

  1. Ph.D. ( 2009.3   Tokyo Medical and Dental University ) 

Research Interests 8

  1. tumor evolution

  2. synthetic lethality

  3. epigenetics

  4. tumor heterogeneity

  5. tumor evolution

  6. synthetic lethality

  7. epigenetics

  8. tumor heterogeneity

Research Areas 4

  1. Life Science / Molecular biology

  2. Life Science / Tumor biology

  3. Life Science / Molecular biology

  4. Life Science / Tumor biology

Research History 9

  1. Nagoya University   Department of Immunology, Graduate School of Medicine/Institute for Advanced Research   Designated associate professor

    2019.7

      More details

    Country:Japan

  2. Nagoya University   Institute for Advanced Research   Designated Associate Professor

    2019.7

  3. Nagoya University   Institute for Advanced Research   Designated associate professor

    2019.7

  4. Nagoya University   Graduate School of Medicine Program in Integrated Medicine Microbiology and Immunology   Designated associate professor

    2019.7

  5. Dana-Farber Cancer Institute   Medical Oncology   Research fellow

    2014.4 - 2019.6

      More details

    Country:Japan

  6. Dana-Farber Cancer Institute   Medical Oncology   Research fellow

    2014.4 - 2019.6

  7. The University of Tokyo   Division of Molecular Therapy, Institute for Medical Science   Designated assistant professor

    2012.4 - 2014.3

      More details

    Country:Japan

  8. The University of Tokyo   Division of Systems Biomedical Technology, Institute for Medical Science,   Designated assistant professor

    2010.4 - 2012.3

      More details

    Country:Japan

  9. The University of Tokyo   Division of Systems Biomedical Technology, Institute for Medical Science,   Post-doctoral fellow

    2009.4 - 2010.3

      More details

    Country:Japan

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Education 2

  1. Tokyo Medical and Dental University   Biomedical Science PhD Program

    2006.4 - 2009.3

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    Country: Japan

  2. Tokyo University of Science   Faculty of Science   Department of Applied Chemistry

    - 2004.3

      More details

    Country: Japan

 

Papers 14

  1. A bifurcation concept for B-lymphoid/plasmacytoid dendritic cells with largely fluctuating transcriptome dynamics.

    Nagaharu K, Kojima Y, Hirose H, Minoura K, Hinohara K, Minami H, Kageyama Y, Sugimoto Y, Masuya M, Nii S, Seki M, Suzuki Y, Tawara I, Shimamura T, Katayama N, Nishikawa H, Ohishi K

    Cell reports   Vol. 40 ( 9 ) page: 111260   2022.8

     More details

    Language:English   Publisher:Cell Reports  

    Hematopoiesis was considered a hierarchical stepwise process but was revised to a continuous process following single-cell RNA sequencing. However, the uncertainty or fluctuation of single-cell transcriptome dynamics during differentiation was not considered, and the dendritic cell (DC) pathway in the lymphoid context remains unclear. Here, we identify human B-plasmacytoid DC (pDC) bifurcation as large fluctuating transcriptome dynamics in the putative B/NK progenitor region by dry and wet methods. By converting splicing kinetics into diffusion dynamics in a deep generative model, our original computational methodology reveals strong fluctuation at B/pDC bifurcation in IL-7Rα+ regions, and LFA-1 fluctuates positively in the pDC direction at the bifurcation. These expectancies are validated by the presence of B/pDC progenitors in the IL-7Rα+ fraction and preferential expression of LFA-1 in pDC-biased progenitors with a niche-like culture system. We provide a model of fluctuation-based differentiation, which reconciles continuous and discrete models and is applicable to other developmental systems.

    DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111260

    Scopus

    PubMed

  2. Cancer immunotherapy with PI3K and PD-1 dual-blockade via optimal modulation of T cell activation signal

    Isoyama Sho, Mori Shigeyuki, Sugiyama Daisuke, Kojima Yasuhiro, Tada Yasuko, Shitara Kohei, Hinohara Kunihiko, Dan Shingo, Nishikawa Hiroyoshi

    JOURNAL FOR IMMUNOTHERAPY OF CANCER   Vol. 9 ( 8 )   2021

     More details

    Language:Japanese   Publisher:Journal for ImmunoTherapy of Cancer  

    Background Immune checkpoint blockade (ICB) induces durable clinical responses in patients with various types of cancer. However, its limited clinical efficacy requires the development of better approaches. In addition to immune checkpoint molecules, tumor-infiltrating immunosuppressive cells including regulatory T cells (Tregs) play crucial roles in the immune suppressive tumor microenvironment. While phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibition as a Treg-targeted treatment has been implicated in animal models, its effects on human Tregs and on the potential impairment of effector T cells are required to be clarified for successful cancer immunotherapy. Methods The impact of a selective-PI3K inhibitor ZSTK474 with or without anti-programmed cell death 1 (PD-1) monoclonal antibody on Tregs and CD8 + T cells were examined with in vivo animal models and in vitro experiments with antigen specific and non-specific fashions using peripheral blood from healthy individuals and cancer patients. Phenotypes and functions of Tregs and effector T cells were examined with comprehensive gene and protein expression assays. Results Improved antitumor effects by the PI3K inhibitor in combination with ICB, particularly PD-1 blockade, were observed in mice and humans. Although administration of the PI3K inhibitor at higher doses impaired activation of CD8 + T cells as well as Tregs, the optimization (doses and timing) of this combination treatment selectively decreased intratumoral Tregs, resulting in increased tumor antigen-specific CD8 + T cells in the treated mice. Moreover, on the administration of the PI3K inhibitor with the optimal dose for selectively deleting Tregs, PI3K signaling was inhibited not only in Tregs but also in activated CD8 + T cells, leading to the enhanced generation of tumor antigen-specific memory CD8 + T cells which contributed to durable antitumor immunity. These opposing outcomes between Tregs and CD8 + T cells were attributed to the high degree of dependence on T cell signaling in the former but not in the latter. Conclusions PI3K inhibitor in the combination with ICB with the optimized protocol fine-tuned T cell activation signaling for antitumor immunity via decreasing Tregs and optimizing memory CD8 + T cell responses, illustrating a promising combination therapy.

    DOI: 10.1136/jitc-2020-002279

    Web of Science

    Scopus

    PubMed

  3. Synthetic Lethal and Resistance Interactions with BET Bromodomain Inhibitors in Triple-Negative Breast Cancer.

    Molecular cell   Vol. 78 ( 6 ) page: 1096 - 1113.e8   2020.6

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.molcel.2020.04.027

    PubMed

  4. Perturbed myoepithelial cell differentiation in BRCA mutation carriers and in ductal carcinoma in situ

    Ding Lina, Su Ying, Fassl Anne, Hinohara Kunihiko, Qiu Xintao, Harper Nicholas W, Huh Sung Jin, Bloushtain-Qimron Noga, Jovanovic Bojana, Ekram Muhammad, Zi Xiaoyuan, Hines William C, Aleckovic Masa, del Alcazar Carlos Gil, Caulfield Ryan J, Bonal Dennis M, Quang-De Nguyen, Merino Vanessa F, Choudhury Sibgat, Ethington Gabrielle, Panos Laura, Grant Michael, Herlihy William, Au Alfred, Rosson Gedge D, Argani Pedram, Richardson Andrea L, Dillon Deborah, Allred D. Craig, Babski Kirsten, Kim

    NATURE COMMUNICATIONS   Vol. 10 ( 1 ) page: 4182   2019.9

     More details

    Language:Japanese   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1038/s41467-019-12125-5

    Web of Science

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    PubMed

  5. MRTF-A regulates proliferation and survival properties of pro-atherogenic macrophages.

    An J, Naruse TK, Hinohara K, Soejima Y, Sawabe M, Nakagawa Y, Kuwahara K, Kimura A

    Journal of molecular and cellular cardiology   Vol. 133   page: 26 - 35   2019.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    We have previously reported that promoter polymorphism of myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) is associated with coronary atherosclerosis. However, the contribution of MRTF-A to the development of atherosclerosis remains unknown. Macrophages are known to be important mediators of atherosclerosis. It has been demonstrated that local proliferation and survival of macrophages are atherogenic. In this study, we found that MRTF-A was highly expressed in lesional macrophages in human carotid atherosclerotic plaque. We then investigated the role of macrophagic MRTF-A in the pathogenesis of atherosclerosis. ApoE null MRTF-A transgenic mice (ApoE−/−/MRTF-Atg/+), in which human MRTF-A was specifically overexpressed in monocytes/macrophages, were established and fed with normal diet to examine the progression of atherosclerosis. We found that ApoE−/−/MRTF-Atg/+ aggravated atherosclerosis and lesional macrophages were more prominently accumulated in the aortic sinus of ApoE−/−/MRTF-Atg/+ than in that of ApoE−/− littermates. We also found that MRTF-A promoted proliferation and mitigated apoptosis of macrophages both in vitro and in vivo, and down regulated the expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. From these findings, we conclude that MRTF-A modulates functional properties of pro-atherogenic macrophages. Our study may play a valuable role in understanding the pathological role of macrophagic MRTF-A in the progression of atherosclerosis.

    DOI: 10.1016/j.yjmcc.2019.05.015

    Scopus

    PubMed

  6. Intratumoral Heterogeneity: More Than Just Mutations.

    Hinohara K, Polyak K

    Trends in cell biology   Vol. 29 ( 7 ) page: 569 - 579   2019.7

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.tcb.2019.03.003

    PubMed

  7. MUC1-C Integrates Chromatin Remodeling and PARP1 Activity in the DNA Damage Response of Triple-Negative Breast Cancer Cells.

    Yamamoto M, Jin C, Hata T, Yasumizu Y, Zhang Y, Hong D, Maeda T, Miyo M, Hiraki M, Suzuki Y, Hinohara K, Rajabi H, Kufe D

    Cancer research   Vol. 79 ( 8 ) page: 2031 - 2041   2019.4

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:AMER ASSOC CANCER RESEARCH  

    The oncogenic MUC1-C protein is overexpressed in triple-negative breast cancer (TNBC) cells and contributes to their epigenetic reprogramming and chemoresistance. Here we show that targeting MUC1-C genetically or pharmacologically with the GO-203 inhibitor, which blocks MUC1-C nuclear localization, induced DNA double-strand breaks and potentiated cisplatin (CDDP)-induced DNA damage and death. MUC1-C regulated nuclear localization of the polycomb group proteins BMI1 and EZH2, which formed complexes with PARP1 during the DNA damage response. Targeting MUC1-C downregulated BMI1-induced H2A ubiquitylation, EZH2-driven H3K27 trimethylation, and activation of PARP1. As a result, treatment with GO-203 synergistically sensitized both mutant and wild-type BRCA1 TNBC cells to the PARP inhibitor olaparib. These findings uncover a role for MUC1-C in the regulation of PARP1 and identify a therapeutic strategy for enhancing the effectiveness of PARP inhibitors against TNBC.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3259

    Web of Science

    PubMed

  8. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment.

    Ding L, Shunkwiler LB, Harper NW, Zhao Y, Hinohara K, Huh SJ, Ekram MB, Guz J, Kern MJ, Awgulewitsch A, Shull JD, Smits BMG, Polyak K

    PLoS genetics   Vol. 15 ( 3 ) page: e1008002   2019.3

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1371/journal.pgen.1008002

    PubMed

  9. KDM5 Histone Demethylase Activity Links Cellular Transcriptomic Heterogeneity to Therapeutic Resistance.

    Cancer cell   Vol. 35 ( 2 ) page: 330 - 332   2019.2

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.ccell.2019.01.012

    PubMed

  10. KDM5 Histone Demethylase Activity Links Cellular Transcriptomic Heterogeneity to Therapeutic Resistance.

    Hinohara K, Wu HJ, Vigneau S, McDonald TO, Igarashi KJ, Yamamoto KN, Madsen T, Fassl A, Egri SB, Papanastasiou M, Ding L, Peluffo G, Cohen O, Kales SC, Lal-Nag M, Rai G, Maloney DJ, Jadhav A, Simeonov A, Wagle N, Brown M, Meissner A, Sicinski P, Jaffe JD, Jeselsohn R, Gimelbrant AA, Michor F, Polyak K

    Cancer cell   Vol. 34 ( 6 ) page: 939 - 953.e9   2018.12

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.ccell.2018.10.014

    PubMed

  11. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.

    Ben-David U, Siranosian B, Ha G, Tang H, Oren Y, Hinohara K, Strathdee CA, Dempster J, Lyons NJ, Burns R, Nag A, Kugener G, Cimini B, Tsvetkov P, Maruvka YE, O'Rourke R, Garrity A, Tubelli AA, Bandopadhayay P, Tsherniak A, Vazquez F, Wong B, Birger C, Ghandi M, Thorner AR, Bittker JA, Meyerson M, Getz G, Beroukhim R, Golub TR

    Nature   Vol. 560 ( 7718 ) page: 325 - 330   2018.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1038/s41586-018-0409-3

    PubMed

  12. ATR inhibition controls aggressive prostate tumors deficient in Y-linked histone demethylase KDM5D International journal

    Komura Kazumasa, Yoshikawa Yuki, Shimamura Teppei, Chakraborty Goutam, Gerke Travis A, Hinohara Kunihiko, Chadalavada Kalyani, Jeong Seong Ho, Armenia Joshua, Du Shin-Yi, Mazzu Ying Z, Taniguchi Kohei, Ibuki Naokazu, Meyer Clifford A, Nanjangud Gouri J, Inamoto Teruo, Lee Gwo-Shu Mary, Mucci Lorelei A, Azuma Haruhito, Sweeney Christopher J, Kantoff Philip W

    JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION   Vol. 128 ( 7 ) page: 2979 - 2995   2018.7

     More details

    Language:Japanese   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    Epigenetic modifications control cancer development and clonal evolution in various cancer types. Here, we show that loss of the male-specific histone demethylase lysine-specific demethylase 5D (KDM5D) encoded on the Y chromosome epigenetically modifies histone methylation marks and alters gene expression, resulting in aggressive prostate cancer. Fluorescent in situ hybridization demonstrated that segmental or total deletion of the Y chromosome in prostate cancer cells is one of the causes of decreased KDM5D mRNA expression. The result of ChIP-sequencing analysis revealed that KDM5D preferably binds to promoter regions with coenrichment of the motifs of crucial transcription factors that regulate the cell cycle. Loss of KDM5D expression with dysregulated H3K4me3 transcriptional marks was associated with acceleration of the cell cycle and mitotic entry, leading to increased DNA-replication stress. Analysis of multiple clinical data sets reproducibly showed that loss of expression of KDM5D confers a poorer prognosis. Notably, we also found stress-induced DNA damage on the serine/threonine protein kinase ATR with loss of KDM5D. In KDM5D-deficient cells, blocking ATR activity with an ATR inhibitor enhanced DNA damage, which led to subsequent apoptosis. These data start to elucidate the biological characteristics resulting from loss of KDM5D and also provide clues for a potential novel therapeutic approach for this subset of aggressive prostate cancer.

    DOI: 10.1172/JCI96769

    Web of Science

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    PubMed

  13. ER Stress Signaling Promotes the Survival of Cancer "Persister Cells" Tolerant to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors International journal

    Terai Hideki, Kitajima Shunsuke, Potter Danielle S, Matsui Yusuke, Quiceno Laura Gutierrez, Chen Ting, Kim Tae-jung, Rusan Maria, Thai Tran C, Piccioni Federica, Donovan Katherine A, Kwiatkowski Nicholas, Hinohara Kunihiko, Wei Guo, Gray Nathanael S, Fischer Eric S, Wong Kwok-Kin, Shimamura Teppei, Letai Anthony, Hammerman Peter S, Barbie David A

    CANCER RESEARCH   Vol. 78 ( 4 ) page: 1044 - 1057   2018.2

     More details

    Language:Japanese   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    An increasingly recognized component of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) involves persistence of a drug-tolerant subpopulation of cancer cells that survive despite effective eradication of the majority of the cell population. Multiple groups have demonstrated that these drug-tolerant persister cells undergo transcriptional adaptation via an epigenetic state change that promotes cell survival. Because this mode of TKI drug tolerance appears to involve transcriptional addiction to specific genes and pathways, we hypothesized that systematic functional screening of EGFR TKI/transcriptional inhibitor combination therapy would yield important mechanistic insights and alternative drug escape pathways. We therefore performed a genome-wide CRISPR/Cas9 enhancer/suppressor screen in EGFR-dependent lung cancer PC9 cells treated with erlotinib + THZ1 (CDK7/12 inhibitor) combination therapy, a combination previously shown to suppress drug-tolerant cells in this setting. As expected, suppression of multiple genes associated with transcriptional complexes (EP300, CREBBP, and MED1) enhanced erlotinib/THZ1 synergy. Unexpectedly, we uncovered nearly every component of the recently described ufmylation pathway in the synergy suppressor group. Loss of ufmylation did not affect canonical downstream EGFR signaling. Instead, absence of this pathway triggered a protective unfolded protein response associated with STING upregulation, promoting protumorigenic inflammatory signaling but also unique dependence on Bcl-xL. These data reveal that dysregulation of ufmylation and ER stress comprise a previously unrecognized TKI drug tolerance pathway that engages survival signaling, with potentially important therapeutic implications.Significance: These findings reveal a novel function of the recently described ufmylation pathway, an ER stress survival signaling in drug-tolerant persister cells, which has important biological and therapeutic implications. Cancer Res; 78(4); 1044-57. ©2017 AACR.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1904

    Web of Science

    Scopus

    PubMed

  14. MUC1-C Induces PD-L1 and Immune Evasion in Triple-Negative Breast Cancer.

    Maeda T, Hiraki M, Jin C, Rajabi H, Tagde A, Alam M, Bouillez A, Hu X, Suzuki Y, Miyo M, Hata T, Hinohara K, Kufe D

    Cancer research   Vol. 78 ( 1 ) page: 205 - 215   2018.1

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:AMER ASSOC CANCER RESEARCH  

    The immune checkpoint ligand PD-L1 and the transmembrane mucin MUC1 are upregulated in triple-negative breast cancer (TNBC), where they contribute to its aggressive pathogenesis. Here, we report that genetic or pharmacological targeting of the oncogenic MUC1 subunit MUC1-C is sufficient to suppress PD-L1 expression in TNBC cells. Mechanistic investigations showed that MUC1-C acted to elevate PD-L1 transcription by recruitment of MYC and NF-kappa B p65 to the PD-L1 promoter. In an immunocompetent model of TNBC in which Eo771/MUC1-C cells were engrafted into MUC1 transgenic mice, we showed that targeting MUC1-C associated with PD-L1 suppression, increases in tumor- infiltrating CD8(+) T cells and tumor cell killing. MUC1 expressionin TNBCs also correlated inversely with CD8, CD69, and GZMB, and downregulation of these markers associated with decreased survival. Taken together, our findings show how MUC1 contributes to immune escape in TNBC, and they offer a rationale to target MUC1-C as a novel immunotherapeutic approach for TNBC treatment. (C) 2017 AACR.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1636

    Web of Science

    PubMed

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Research Project for Joint Research, Competitive Funding, etc. 1

  1. Mechanism for synthetic lethality in SWI/SNF-deficient breast cancers

    2019.8 - 2021.3

    Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) 

      More details

    Grant type:Competitive

KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research) 7

  1. がん免疫療法における耐性化機序と進化軌跡の解明

    Grant number:22K18381  2022.6 - 2025.3

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(開拓)

    日野原 邦彦

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\26000000 ( Direct Cost: \20000000 、 Indirect Cost:\6000000 )

    本研究では、1つの細胞を転写ランドスケープレベルで追跡可能な発現型バーコード技術を利用し、ACTに対する固形がんの耐性化過程を追跡する。ACT過程における個々のがん細胞の運命を発現型バーコード情報から1細胞レベルで空間的に明らかにし、ACTに対する耐性進化軌跡の時空間的な理解を図る。多様性を示す個々のがん細胞の免疫応答に関する機能的な境界を高解像度で解明することに挑戦し、ACT耐性細胞の発生起源とその維持に関わる制御機構を突き止めることを目指す。

  2. エピゲノムダイナミクスに基づくがん多様性の新たな理解

    Grant number:20KK0184  2020.10 - 2023.3

    科学研究費助成事業  国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

    日野原 邦彦, 小嶋 泰弘, 加藤 真一郎

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\18720000 ( Direct Cost: \14400000 、 Indirect Cost:\4320000 )

    本研究課題では、クロマチン制御因子SWI/SNF複合体の遺伝子変異によって生じるエピジェネティクス制御機構の破綻が、発がん、治療耐性、再発といった悪性形質獲得に至る過程においてどのようにがん細胞の多様性を造出し、悪性化進展基盤を成すのかを1細胞エピゲノム解析技術によって解き明かす。1細胞エピゲノム情報を取り入れた統合解析を推進することにより、遺伝的要因とは異なるエピゲノム制御の側面からがん多様性の新たな理解を試み、エピゲノムのダイナミクスから生み出されるがんの不均一性を制御する革新的方法論の創出を目指す。
    本年度は、海外共同研究機関からARID2変異陽性のメラノーマ細胞とタキサン系抗癌剤耐性乳がん細胞の提供を受け、これらの細胞株に対して野生型ARID2を導入した細胞実験モデルの構築を行った。本モデルを用いてARID2が実際に細胞増殖に関与するかを検証したところ、ARID2レスキューによってメラノーマ・薬剤耐性乳がん共に細胞増殖能が低下することを見出した。これらの知見はそれぞれのコンテクストにおけるARID2の重要性を示唆するものであった。加えて、ARID2野生型のメラノーマ細胞と薬剤感受性乳がん細胞を対象とし、CRISPR/Cas9を用いてARID2ノックアウト細胞株を樹立した。メラノーマでは発症初期に認められるARID2の機能欠失変異に一致してARID2のノックアウトによって細胞増殖能の亢進が認められたことに加え、メラノサイト細胞系譜特有の表現型であるメラニン産生が低下することを明らかにした。これらは、我々が想定した細胞系譜もしくは時期特異的なARID2変異の生物学的意義を間接的に示唆するものと考える。一方、薬剤感受性乳がん細胞ではARID2ノックアウトによる細胞増殖能の亢進・薬剤耐性化は認められなかったことから、進行再発乳がんに認められるARID2変異は薬剤耐性化のドライバー因子ではなく耐性化した細胞の増殖能に関わるものと考えられた。加えて、来年度に実施予定の1細胞解析に先立ち、これらのモデル細胞株のバルクRNA-seq解析を行い、ARID2のレスキューによって薬剤耐性乳がんの炎症応答パスウェイが変化することを明らかにした。海外共同研究機関とはウェブベースでのミーティングを随時オンラインにて行っており、本年度の研究成果をもとに来年度以降で海外共同研究者の保有する最先端エピゲノム研究の見地を取り入れた研究を展開していくための議論を進めている。
    当初の計画に沿って、海外共同研究機関からARID2変異メラノーマ細胞とARID2変異薬剤耐性乳がん細胞の提供を受け、これらを対象とした野生型ARID2のレスキュー系を樹立した。SWI/SNF複合体を構成する因子群は、片側アレルの不活化変異に伴う遺伝子発現の量的な低下によって野生型表現型を失うこと(Haploinsufficiency)が知られており、我々の細胞株モデルも1アレルに不活化変異を有していることから、ドキシサイクリン誘導性に野生型ARID2を発現するレンチウイルスを1細胞につき1コピー導入が起こるように低タイターで感染させた。ARID2の1コピーレスキューによってメラノーマ・耐性乳がん共に細胞増殖能の低下が認められたことから、今後実施予定の1細胞解析を基軸としたマルチモーダル解析に供する細胞株モデルを確立できたと考えている。これらのレスキューモデルに対するコントロールとして、野生型ARID2を保有する複数の細胞株についてもARID2ノックアウト細胞株を樹立した。耐性乳がん細胞株におけるARID2レベルの変化がどのようにトランスクリプトームに影響するかについては、既にバルクレベルのRNA-seq解析を終えており、ARID2のレスキューによって炎症応答パスウェイが変化することを見出している。この結果は、作成したモデル細胞株においてARID2のレスキューがトランスクリプトームレベルで作用していることを示しており、来年度以降、1細胞RNA-seq・ATAC-seqを行うことで、バルクレベルと1細胞レベルでのトランスクリプトーム・エピゲノム変化の対応関係を明らかにするための準備が整ったと言える。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    ARID2の発現レベルにおける量的変化がいかにしてトランスクリプトームやエピゲノムといった細胞表現型の多様性に寄与し得るかを明らかにするには、ARID2の変化がどのような1細胞レベルの変化を引き起こすかについて1細胞RNA-seq・ATAC-seqによる解析を推進する必要がある。当初の予定では、1細胞エピゲノム解析のエキスパートである海外共同研究機関現地にてサポートを受けることでこれらの解析を実施していく予定としていたが、現状では新型コロナウイルスによるパンデミックの影響で海外への渡航が厳しく制限されている。そこで、研究の進捗への影響を最小限とするために、現在ウェブベースでリモートにて海外共同研究機関からハンズオントレーニングを受ける準備を進めている。1細胞解析装置等の実験設備は研究代表者の所属機関に配備済みであることから、リモートトレーニングによって技術的に習熟した後には迅速に1細胞解析の実施へと移行することが可能である。渡航制限が解除された際には海外共同研究機関に赴き、現地研究者との緊密な連携のもと実験と解析を推進していく予定としている。1細胞データの解析では、ARID2レスキューによってトランスクリプトームのクラスター(細胞集団)が新たに出現するかどうか、新規に出現したトランスクリプトームのクラスターがエピゲノムレベルでの新規のクラスター出現により実現されているのかを検証し、トランスクリプトーム多様性の背後に、エピゲノム変化による転写現象の確率的なゆらぎの増大があるのか、エピゲノム自体の多様化があるのかを明らかにしていく。これらの1細胞形質動態から、異なるがん病態・がん種にまたがるARID2変異の腫瘍生物学的な意義を見出す。

  3. 1細胞バーコード法によるがん免疫逃避機構の解明

    Grant number:20K21542  2020.7 - 2022.3

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(萌芽)

    日野原 邦彦

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\6500000 ( Direct Cost: \5000000 、 Indirect Cost:\1500000 )

    免疫系は自己・非自己を識別し、微生物などの非自己を排除するだけでなく、生体の恒常性を保つ上で極めて重要な役割を担っている。近年がん免疫療法が実用化されたことは記憶に新しいが、がんの組織は遺伝的・形質的に異なる多様ながん細胞により構成されているため、治療に対して抵抗性を示すクローンが生き残ってしまうことが課題となっている。このようながんの薬剤耐性化機序は、ダーウィン進化論的に突然変異と自然淘汰を経た適者生存として捉えることができる。本研究では、1細胞をバーコードによりラベルしてその進化軌跡を追跡する技術を応用し、個々のがん細胞が細胞傷害性T細胞からどのように逃れて増殖するに至るかを解明する。
    本年度は、マウスでのCTL耐性進化軌跡の解明に向けたがん細胞株移植モデルを確立した。具体的には、neoantigenとしてmERK2を持つマウス繊維肉腫の細胞株CMS5aとmERK2特異的なTCRを持つトランスジェニックマウスDUC18の組み合わせを対象とし、がん細胞側の多様性がどのように養子免疫療法(Adoptive T cell therapy : ACT)から逃れて耐性化するかを検討するための実験系を構築した。mERK2特異的なT細胞の移植によって一旦増殖抑制はかかるものの、全ての移植群で最終的には耐性化したがん細胞集団が再増殖してくることがわかった。エクソームシークエンス解析からは、耐性がんが完全にmERK2-negativeであることが同定され、腫瘍特異抗原の消失による免疫逃避機構が明らかとなった。GFPラベルした耐性細胞とDsRedラベルした感受性細胞の混合移植実験では、ACT後の腫瘍組織が全てGFP-positiveであったことから、治療後に増殖してくる集団はpre-existingかつgenetically distinctな耐性細胞由来であることが示唆された。しかしながら、感受性細胞集団をシングルセルクローン化して移植実験を行った結果、非常にレアな確率で耐性化するケースが認められたため、上記の先天的耐性化モデル以外に後天的な獲得耐性による薬剤耐性化機構も存在することがわかった。現在、個々のがん細胞をバーコードライブラリでラベルしたCMS5a細胞株の準備と移植実験系の構築を進めており、本実験モデルからバーコード情報によるFate Mappingを行うことでACTに対する耐性進化軌跡の統合的解明を目指す。
    ACTに対する耐性化実験モデルとして、mERK2変異陽性のマウス繊維肉腫の細胞株CMS5aとmERK2特異的TCRを持つトランスジェニックマウスDUC18の組み合わせの実験系構築を終えた。エクソームシークエンスやシングルセルクローン解析によってCMS5aにおける耐性化メカニズムの検証を進め、薬剤耐性化は(1)mERK2変異を欠損したpre-existingな耐性細胞に由来し得ること、(2)後天的にも耐性化変異を獲得し得ることの両者によってもたらされることを見出した。感受性細胞のシングルセルクローンが一部後天的に耐性を獲得する機構が発見されたため、どのようなコンテクストにおいて獲得耐性化が起こるのかを検討し、ACTの開始タイミングがキーとなっていることを見出した。具体的には移植5日後にACTを開始すると全ての移植群で耐性化してこないのに対し、治療開始を遅らせるに従って耐性化の頻度が上昇し、移植17日後からACTを開始した群では全て耐性化した。これらの結果は、ACTに対する耐性化メカニズムの複雑性が高いこと、単純な移植実験モデルではその全容解明が困難であることを示すものであった。そこで当初の計画通り、現在一つひとつのCMS5a細胞を異なるバーコードでラベルして追跡する移植実験系の構築を進めている。バーコードライブラリウイルスの準備とその感染まで終えており、今後このバーコード化細胞を実際に移植してACT耐性化実験を進める予定である。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    1細胞ごとに異なるバーコードでラベルして進化軌跡を時間的に追跡することで、上記の異なる耐性化メカニズムがいつどのように発現してくるのかを明らかにしていく。バーコード化細胞の移植実験では、移植細胞数やACTの投与開始日等について上述の最適化した実験系を用いて解析を進める。耐性化に伴って増大する腫瘍組織を時系列にサンプリングし、次世代シークエンスにてバーコード情報を紐解く。これらの実験を複数のマウスレプリケイトを準備して実施し、レプリケイト間で同一バーコードが濃縮するのか異なるバーコードが同定されるのかを解析することで、それぞれpre-existingとacquired resistanceを判別する。本年度の進化軌跡解析からは、pre-existingな耐性獲得機構の主要因として遺伝子変異が示唆されているため、バーコード化細胞の耐性化モデルについても蛍光in situハイブリダイゼーションによる染色体解析やエクソームシークエンスによる遺伝子変異解析を行う。一方で、ACT開始日の遅延に従って感受性細胞クローンが耐性化する獲得機構に関しては不明瞭な部分が多いが、薬剤投与されるとエピジェネティック機構を利用して休眠状態となるパーシスター細胞の存在が示唆される場合は、ヒストンマススペクトロメトリーやクロマチン免疫沈降シークエンス等により解析を進め、どのようなエピジェネティック変化がパーシスター細胞集団を規定しているかを解明する。本研究の推進により、多様ながん細胞集団における個々の細胞のACT応答に関する機能的な境界が同定され、ACT耐性細胞の発生起源とその維持に関わる制御機構を突き止めることが可能となる。これにより、生物が本来的に有する多様性という概念に深く根ざした疾患であるがんの免疫応答メカニズムに対する理解が深まり、免疫療法の効果を飛躍的に高める突破口を切り開きたい。

  4. がん免疫療法への応用を目指したがん細胞特異的なSTINGアゴニスト輸送体の同定

    Grant number:20K21553  2020.7 - 2022.3

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(萌芽)

    北嶋 俊輔, 日野原 邦彦

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    Authorship:Coinvestigator(s)  Grant type:Competitive

    細胞質内二本鎖DNAセンサーSTING経路を刺激するSTINGアゴニストは、がん細胞や免疫細胞に対して抗ウイルス応答を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。これまでに申請者は、STINGアゴニストの細胞内への取り込み様式ががん細胞と免疫細胞で大きく異なり、がん細胞では同じがん細胞株内であっても、STINGアゴニストの取り込みが単一細胞ごとに大きく異なることを明らかにした。そこで本研究では、STINGアゴニストに対する反応性の有無を基準とした単一細胞解析を行い、これまでに全く見つかっていない、がん細胞において機能的に発現するSTINGアゴニスト輸送体を同定することを目的とする。
    これまでに研究代表者は、がん細胞において細胞質内二本鎖DNAセンサーであるSTING経路が抑制されることにより、がん特異的抗原提示能の低下や腫瘍組織浸潤リンパ球の減少につながり、免疫チェックポイント阻害薬に対する治療抵抗性に寄与することを明らかにした。そこで、がん細胞自身を標的としたSTING経路活性化が、がん免疫療法抵抗性を克服するための治療戦略として有効であると考え、本研究では、これまでにほとんど明らかになっていない細胞内在性STINGアゴニスト2’3’cGAMP(以降cGAMP)の輸送体を同定することを目的とする。
    ① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析
    本年度は、主に単一細胞解析に使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の検討を詳細に行った。STING経路が抑制されていることが報告されている種々のヒト由来の肺がん細胞株、大腸がん細胞株、メラノーマ細胞株を用いて、細胞外にcGAMPを投与したところ、H1944やH2122、H647、A375株などのヒトがん細胞株において、cGAMP投与後3-6時間程度でSTING経路が活性化することを明らかにした。STING経路の活性化には細胞外に分泌されるSTING下流サイトカインCXCL10の濃度をELISAにより評価した。また細胞外に添加するcGAMPの濃度を検討し、投与条件の最適化を行った。
    ② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化
    単一の細胞を転写ランドスケープレベルで追跡するための実験系最適化を行った。発現バーコードライブラリを用いて、A375株を含む複数のがん細胞を一細胞レベルでラベルし、10x Genomics社の1細胞解析キットにてトランスクリプトーム情報とバーコード情報を同時取得するための実験系と解析系の構築を進めた。
    2020年度の研究実施計画は主に「① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析」および「② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化」であった。
    ①に関しては、これまでに研究代表者らやその他のグループから、肺がん細胞や大腸がん細胞、メラノーマ細胞などでSTING経路が抑制されることが報告されており、2020年度はこれら既報の細胞株を用いて、単一細胞解析を行うための細胞外cGAMP投与の最適化を行った。単一細胞間での感受性の差異を検出するため、CXCL10の発現上昇を指標として、短期間かつ低濃度で明確なSTING活性化が観察される条件を検討した。具体的には、細胞株ごとに多少の違いはあるものの、約5-10 mg/mlのcGAMPで3-6時間刺激を行うことが最適であると決定した。本年度は、最適化した条件を用いて、実際に単一細胞発現解析を実施する予定であるが、使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の最適化という2020年度の研究目標に関しては、おおむね順調に達成したと考えられる。
    ②に関しては、主に発現バーコードライブラリのウイルス感染条件最適化とバーコード化細胞の1細胞解析予備実験を行った。細胞ごとに異なるバーコードで標識するため、MOI0.1にてレンチウイルス感染を行い、その後GFPソートすることで複数のバーコード化細胞を樹立した。予備検討として10xによる1細胞解析を行い、データからトランスクリプトーム情報に加えてバーコード情報を取り出す解析手法の確立を進めている。以上より、1細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化という2020年度の研究目標に関して、おおむね順調に達成したと考えられる。
    ① バーコードライブラリーを用いた細胞標識:昨年度に投与条件の最適化を行ったヒトがん細胞株を用いて、RNA型発現バーコードあるいは必要に応じてDNA型バーコードにより標識する。発現バーコードライブラリレンチウイルスをMultiplicity of infection 0.1で感染させ、単一細胞ごとに1万種類の異なる発現バーコードで細胞を標識する。
    ② cGAMP処理前後での単一細胞レベルでの遺伝子発現変動解析:cGAMP未処理あるいは3時間処理したバーコード化済み細胞株からそれぞれRNAを回収した後、10xGenomicsを用いた単一細胞RNAシークエンスにより、バーコード情報と遺伝子発現プロファイルを同時に読み取る。10xGenomicsデータはパイプラインCell Rangerにて解析し、tSNEもしくはSPADEにより可視化することによって2’3’cGAMP処理前後による遺伝子発現変化を単一細胞レベルで捉える。
    ③ cGAMP輸送体候補遺伝子の抽出と機能解析:様々なSTING標的遺伝子を含むGene set「STING SIGNATUR」を用いて、cGAMP処理前後におけるエンリッチメントスコアの変動を計算し、単一細胞レベルでcGAMPに対する反応性の高低による順位付けを行う。次に、刺激前における発現量が反応性と正に相関する遺伝子群を抽出する。次に、CRISPR/Cas9系を用いて候補遺伝子の欠損細胞を作製し、細胞外cGAMPに対する反応性を検討する。STING活性化マーカーとしてCXCL10の分泌亢進をELISAにより測定する。コントロール実験として、トランスフェクションによるcGAMP導入を実施し、候補遺伝子が膜輸送体を介したcGAMP取り込み特異的に作用するか否かを検討する。

  5. The evolutional trajection and precision-medicine to gliomas

    Grant number:20H03789  2020.4 - 2023.3

    Grants-in-Aid for Scientific Research  Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

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    Authorship:Coinvestigator(s)  Grant type:Competitive

  6. 膠芽腫における合成致死性メカニズムの解明

    Grant number:20H03512  2020.4 - 2023.3

    科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    日野原 邦彦

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    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\17810000 ( Direct Cost: \13700000 、 Indirect Cost:\4110000 )

    悪性脳腫瘍である膠芽腫に対する治療薬は現在のところアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)のみであり、そのTMZに対しても最終的に耐性が出現することから、その克服や新規治療法の開発が喫緊の課題である。本研究では、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングによりATRX変異陽性膠芽腫のアキレス腱を発見し、新規合成致死性メカニズムに基づいた新たな治療選択肢の創出を目指す。加えて、ATRX変異によるエピジェネティック変化が細胞のトランスクリプトーム多様性に影響し、それによって膠芽腫の進展や薬剤耐性が誘導されるという新たな仮説を検証する。
    本年度は、ATRX変異陽性の市販の膠芽腫細胞株と患者由来膠芽腫細胞株を用いて、誘導性に野生型ATRXを発現するレスキュー株の作成を試みたが、全く発現誘導されないか、短期的に発現誘導できたとしても時間経過と共に発現抑制がかかってしまうという結果であった。IDH変異陽性の星細胞腫ではATRX変異が初期のドライバー因子であることが報告されており、今回用いた膠芽腫細胞株においてもATRX変異がその生存自体に重要である可能性が示唆されるため、ATRXをレスキューした細胞が何らかのメカニズムを介して排除され、レスキューを回避した細胞が残存してきていることも想定された。一方、ATRXレスキューと並行して進めてきたATRX抑制系の確立においては、CRISPRによるATRXノックアウト細胞株を複数樹立することに成功した。そこで現在、ATRXをノックアウトしても増殖能に影響のないことを確認したこれらの野生型ATRX発現株を対象として、CRISPRスクリーニングを実施するための誘導性ATRX抑制株の作成を進めている。スクリーニングに関しては、これら細胞株の樹立に先立って必要なCRISPRライブラリウイルスを準備し、コントロール細胞にてウイルス実験と解析パイプラインがワークすることを確認した。加えて、ATRXによるエピゲノム制御機構を明らかにするためにATRXのChIP-seqの実験系最適化も並行して進め、現在シークエンスデータ解析を行っている。以上のように、本年度は来年度以降のスクリーニングと機能解析に向けた実験・解析系の確立を進めた。
    当初計画していたATRX変異陽性の膠芽腫細胞株に野生型ATRXを発現誘導するレスキュー株の作成は予定通りに進まなかったが、IDH変異陽性の星細胞腫ではATRX変異が初期のドライバー因子であることが報告されていることから、ATRX変異が膠芽腫の生存にクリティカルでありATRXのレスキュー株の樹立が困難であることは想定内であった。そのため、ATRXの不活化変異をミミックするATRX抑制系の確立を本年度初頭より並行して進めており、現在までに野生型ATRXを保有する複数の膠芽腫細胞株にてATRXをCRISPRでノックアウトした細胞株を樹立している。これらの結果から、ATRX変異をレスキューすることは難しいが、ATRXを抑制することは可能であることが明らかとなったため、来年度にCRISPRスクリーニングを予定通り実施してATRXと合成致死性を示す遺伝子群を同定することが可能であると考えている。また、CRISPRスクリーニング自体に関する準備は順調に進み、予備検討からCRISPRライブラリウイルスのクオリティとスクリーニング実験及び解析パイプラインがワークすることを確認できた。ATRXによるエピゲノム制御機構の全貌を解明するには、ATRXのゲノム結合領域をグローバルに明らかにする必要があるが、ATRXのChIP-seqの実験系最適化も順調に進んでおり、現在までに複数条件下でのライブラリ作成を終えシークエンスデータ解析を行っている。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    ATRXとの合成致死性遺伝子を探索するためにCRISPR/SpCas9を用いたゲノムワイドloss-of-functionスクリーニングを実施するには、CRISPRライブラリと互換性のある形でATRXの抑制系を確立する必要がある。ATRXをCRISPR/SpCas9でノックアウトしても増殖に影響のないATRX野生株を患者由来細胞株及び市販の膠芽腫細胞株にて複数同定しているが、本ノックアウトは同一システムにて作動するCRISPRノックアウトライブラリと交差反応してしまうことから、今後異なるCas9オルソログを用いてATRXをドキシサイクリン誘導性に抑制するCRISPRi実験系の作成を推進する。これらの細胞株を樹立した後に、ATRXのon/off条件下にてCRISPR/ SpCas9システムによるloss-of-functionスクリーニングを実施する。さらに、最適化したATRXのChIP-seqの実験系を用いて種々の細胞株におけるATRX結合領域をグローバルに明らかにするとともに、ATRXのon/off条件下にて変化することが予想されるクロマチンのオープン・クローズ状態をATAC-seqにより解析していく。現在、膠芽腫患者に対する効果的な治療薬はテモゾロミド(TMZ)以外に存在しないため、TMZに対する耐性獲得機構と耐性化におけるATRXの関与についても解析を進め、上記スクリーニング解析と併せた統合的アプローチから膠芽腫の新たな合成致死性・薬剤耐性メカニズムの理解を目指す。

  7. Mechanism for synthetic lethality in SWI/SNF-deficient breast cancers

    2019.8 - 2021.3

    Japan Agency for Medical Research and Development  Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) 

      More details

    Grant type:Competitive

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