Updated on 2023/09/14

写真a

 
HINOHARA Kunihiko
 
Organization
Graduate School of Medicine Designated associate professor
Title
Designated associate professor

Degree 1

  1. Ph.D. ( 2009.3   Tokyo Medical and Dental University ) 

Research Interests 8

  1. tumor evolution

  2. synthetic lethality

  3. epigenetics

  4. tumor heterogeneity

  5. tumor evolution

  6. synthetic lethality

  7. epigenetics

  8. tumor heterogeneity

Research Areas 4

  1. Life Science / Molecular biology

  2. Life Science / Tumor biology

  3. Life Science / Molecular biology

  4. Life Science / Tumor biology

Research History 6

  1. Nagoya University   Department of Immunology, Graduate School of Medicine/Institute for Advanced Research   Designated associate professor

    2019.7

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    Country:Japan

  2. Nagoya University   Institute for Advanced Research   Designated associate professor

    2019.7

  3. Dana-Farber Cancer Institute   Medical Oncology   Research fellow

    2014.4 - 2019.6

  4. The University of Tokyo   Division of Molecular Therapy, Institute for Medical Science   Designated assistant professor

    2012.4 - 2014.3

      More details

    Country:Japan

  5. The University of Tokyo   Division of Systems Biomedical Technology, Institute for Medical Science,   Designated assistant professor

    2010.4 - 2012.3

      More details

    Country:Japan

  6. The University of Tokyo   Division of Systems Biomedical Technology, Institute for Medical Science,   Post-doctoral fellow

    2009.4 - 2010.3

      More details

    Country:Japan

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Education 2

  1. Tokyo Medical and Dental University   Biomedical Science PhD Program

    2006.4 - 2009.3

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    Country: Japan

  2. Tokyo University of Science   Faculty of Science   Department of Applied Chemistry

    - 2004.3

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    Country: Japan

 

Papers 17

  1. The cancer epigenome: Non-cell autonomous player in tumor immunity

    Kato Shinichiro, Maeda Yuka, Sugiyama Daisuke, Watanabe Keisuke, Nishikawa Hiroyoshi, Hinohara Kunihiko

    CANCER SCIENCE   Vol. 114 ( 3 ) page: 730 - 740   2023.3

     More details

    Language:English   Publisher:Cancer Science  

    Dysregulation of the tumor-intrinsic epigenetic circuit is a key driver event for the development of cancer. Accumulating evidence suggests that epigenetic and/or genetic drivers stimulate intrinsic oncogenic pathways as well as extrinsic factors that modulate the immune system. These modulations indeed shape the tumor microenvironment (TME), allowing pro-oncogenic factors to become oncogenic, thereby contributing to cancer development and progression. Here we review the epigenetic dysregulation arising in cancer cells that disseminates throughout the TME and beyond. Recent CRISPR screening has elucidated key epigenetic drivers that play important roles in the proliferation of cancer cells (intrinsic) and inhibition of antitumor immunity (extrinsic), which lead to the development and progression of cancer. These epigenetic players can serve as promising targets for cancer therapy as a dual (two-in-one)-targeted approach. Considering the interplay between cancer and the immune system as a key determinant of immunotherapy, we discuss a novel lineage-tracing technology that enables longitudinal monitoring of cancer and immune phenotypic heterogeneity and fate paths during cancer development, progression, and therapeutic interventions.

    DOI: 10.1111/cas.15681

    Web of Science

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    PubMed

  2. CRISPR screens reveal genetic determinants of PARP inhibitor sensitivity and resistance in prostate cancer

    Tsujino Takuya, Takai Tomoaki, Hinohara Kunihiko, Gui Fu, Tsutsumi Takeshi, Bai Xiao, Miao Chenkui, Feng Chao, Gui Bin, Sztupinszki Zsofia, Simoneau Antoine, Xie Ning, Fazli Ladan, Dong Xuesen, Azuma Haruhito, Choudhury Atish D. D., Mouw Kent W. W., Szallasi Zoltan, Zou Lee, Kibel Adam S. S., Jia Li

    NATURE COMMUNICATIONS   Vol. 14 ( 1 ) page: 252   2023.1

     More details

    Language:English   Publisher:Nature Communications  

    Prostate cancer harboring BRCA1/2 mutations are often exceptionally sensitive to PARP inhibitors. However, genomic alterations in other DNA damage response genes have not been consistently predictive of clinical response to PARP inhibition. Here, we perform genome-wide CRISPR-Cas9 knockout screens in BRCA1/2-proficient prostate cancer cells and identify previously unknown genes whose loss has a profound impact on PARP inhibitor response. Specifically, MMS22L deletion, frequently observed (up to 14%) in prostate cancer, renders cells hypersensitive to PARP inhibitors by disrupting RAD51 loading required for homologous recombination repair, although this response is TP53-dependent. Unexpectedly, loss of CHEK2 confers resistance rather than sensitivity to PARP inhibition through increased expression of BRCA2, a target of CHEK2-TP53-E2F7-mediated transcriptional repression. Combined PARP and ATR inhibition overcomes PARP inhibitor resistance caused by CHEK2 loss. Our findings may inform the use of PARP inhibitors beyond BRCA1/2-deficient tumors and support reevaluation of current biomarkers for PARP inhibition in prostate cancer.

    DOI: 10.1038/s41467-023-35880-y

    Web of Science

    Scopus

    PubMed

  3. [Cancer Phenotypic Plasticity and Therapeutic Resistance].

    Hinohara K

    Gan to kagaku ryoho. Cancer & chemotherapy   Vol. 50 ( 1 ) page: 7 - 12   2023.1

     More details

    Language:Japanese  

    PubMed

  4. A bifurcation concept for B-lymphoid/plasmacytoid dendritic cells with largely fluctuating transcriptome dynamics

    Nagaharu Keiki, Kojima Yasuhiro, Hirose Haruka, Minoura Kodai, Hinohara Kunihiko, Minami Hirohito, Kageyama Yuki, Sugimoto Yuka, Masuya Masahiro, Nii Shigeru, Seki Masahide, Suzuki Yutaka, Tawara Isao, Shimamura Teppei, Katayama Naoyuki, Nishikawa Hiroyoshi, Ohishi Kohshi

    CELL REPORTS   Vol. 40 ( 9 ) page: 111260   2022.8

     More details

    Language:English   Publisher:Cell Reports  

    Hematopoiesis was considered a hierarchical stepwise process but was revised to a continuous process following single-cell RNA sequencing. However, the uncertainty or fluctuation of single-cell transcriptome dynamics during differentiation was not considered, and the dendritic cell (DC) pathway in the lymphoid context remains unclear. Here, we identify human B-plasmacytoid DC (pDC) bifurcation as large fluctuating transcriptome dynamics in the putative B/NK progenitor region by dry and wet methods. By converting splicing kinetics into diffusion dynamics in a deep generative model, our original computational methodology reveals strong fluctuation at B/pDC bifurcation in IL-7Rα+ regions, and LFA-1 fluctuates positively in the pDC direction at the bifurcation. These expectancies are validated by the presence of B/pDC progenitors in the IL-7Rα+ fraction and preferential expression of LFA-1 in pDC-biased progenitors with a niche-like culture system. We provide a model of fluctuation-based differentiation, which reconciles continuous and discrete models and is applicable to other developmental systems.

    DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111260

    Web of Science

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    PubMed

  5. Cancer immunotherapy with PI3K and PD-1 dual-blockade via optimal modulation of T cell activation signal

    Isoyama Sho, Mori Shigeyuki, Sugiyama Daisuke, Kojima Yasuhiro, Tada Yasuko, Shitara Kohei, Hinohara Kunihiko, Dan Shingo, Nishikawa Hiroyoshi

    JOURNAL FOR IMMUNOTHERAPY OF CANCER   Vol. 9 ( 8 )   2021

     More details

    Language:Japanese   Publisher:Journal for ImmunoTherapy of Cancer  

    Background Immune checkpoint blockade (ICB) induces durable clinical responses in patients with various types of cancer. However, its limited clinical efficacy requires the development of better approaches. In addition to immune checkpoint molecules, tumor-infiltrating immunosuppressive cells including regulatory T cells (Tregs) play crucial roles in the immune suppressive tumor microenvironment. While phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibition as a Treg-targeted treatment has been implicated in animal models, its effects on human Tregs and on the potential impairment of effector T cells are required to be clarified for successful cancer immunotherapy. Methods The impact of a selective-PI3K inhibitor ZSTK474 with or without anti-programmed cell death 1 (PD-1) monoclonal antibody on Tregs and CD8 + T cells were examined with in vivo animal models and in vitro experiments with antigen specific and non-specific fashions using peripheral blood from healthy individuals and cancer patients. Phenotypes and functions of Tregs and effector T cells were examined with comprehensive gene and protein expression assays. Results Improved antitumor effects by the PI3K inhibitor in combination with ICB, particularly PD-1 blockade, were observed in mice and humans. Although administration of the PI3K inhibitor at higher doses impaired activation of CD8 + T cells as well as Tregs, the optimization (doses and timing) of this combination treatment selectively decreased intratumoral Tregs, resulting in increased tumor antigen-specific CD8 + T cells in the treated mice. Moreover, on the administration of the PI3K inhibitor with the optimal dose for selectively deleting Tregs, PI3K signaling was inhibited not only in Tregs but also in activated CD8 + T cells, leading to the enhanced generation of tumor antigen-specific memory CD8 + T cells which contributed to durable antitumor immunity. These opposing outcomes between Tregs and CD8 + T cells were attributed to the high degree of dependence on T cell signaling in the former but not in the latter. Conclusions PI3K inhibitor in the combination with ICB with the optimized protocol fine-tuned T cell activation signaling for antitumor immunity via decreasing Tregs and optimizing memory CD8 + T cell responses, illustrating a promising combination therapy.

    DOI: 10.1136/jitc-2020-002279

    Web of Science

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    PubMed

  6. Synthetic Lethal and Resistance Interactions with BET Bromodomain Inhibitors in Triple-Negative Breast Cancer.

    Molecular cell   Vol. 78 ( 6 ) page: 1096 - 1113.e8   2020.5

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.molcel.2020.04.027

    PubMed

  7. Perturbed myoepithelial cell differentiation in BRCA mutation carriers and in ductal carcinoma in situ

    Ding Lina, Su Ying, Fassl Anne, Hinohara Kunihiko, Qiu Xintao, Harper Nicholas W, Huh Sung Jin, Bloushtain-Qimron Noga, Jovanovic Bojana, Ekram Muhammad, Zi Xiaoyuan, Hines William C, Aleckovic Masa, del Alcazar Carlos Gil, Caulfield Ryan J, Bonal Dennis M, Quang-De Nguyen, Merino Vanessa F, Choudhury Sibgat, Ethington Gabrielle, Panos Laura, Grant Michael, Herlihy William, Au Alfred, Rosson Gedge D, Argani Pedram, Richardson Andrea L, Dillon Deborah, Allred D. Craig, Babski Kirsten, Kim

    NATURE COMMUNICATIONS   Vol. 10 ( 1 ) page: 4182   2019.9

     More details

    Language:Japanese   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1038/s41467-019-12125-5

    Web of Science

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    PubMed

  8. MRTF-A regulates proliferation and survival properties of pro-atherogenic macrophages.

    An J, Naruse TK, Hinohara K, Soejima Y, Sawabe M, Nakagawa Y, Kuwahara K, Kimura A

    Journal of molecular and cellular cardiology   Vol. 133   page: 26-35 - 35   2019.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    We have previously reported that promoter polymorphism of myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) is associated with coronary atherosclerosis. However, the contribution of MRTF-A to the development of atherosclerosis remains unknown. Macrophages are known to be important mediators of atherosclerosis. It has been demonstrated that local proliferation and survival of macrophages are atherogenic. In this study, we found that MRTF-A was highly expressed in lesional macrophages in human carotid atherosclerotic plaque. We then investigated the role of macrophagic MRTF-A in the pathogenesis of atherosclerosis. ApoE null MRTF-A transgenic mice (ApoE−/−/MRTF-Atg/+), in which human MRTF-A was specifically overexpressed in monocytes/macrophages, were established and fed with normal diet to examine the progression of atherosclerosis. We found that ApoE−/−/MRTF-Atg/+ aggravated atherosclerosis and lesional macrophages were more prominently accumulated in the aortic sinus of ApoE−/−/MRTF-Atg/+ than in that of ApoE−/− littermates. We also found that MRTF-A promoted proliferation and mitigated apoptosis of macrophages both in vitro and in vivo, and down regulated the expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. From these findings, we conclude that MRTF-A modulates functional properties of pro-atherogenic macrophages. Our study may play a valuable role in understanding the pathological role of macrophagic MRTF-A in the progression of atherosclerosis.

    DOI: 10.1016/j.yjmcc.2019.05.015

    Scopus

    PubMed

  9. Intratumoral Heterogeneity: More Than Just Mutations.

    Hinohara K, Polyak K

    Trends in cell biology   Vol. 29 ( 7 ) page: 569-579 - 579   2019.7

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.tcb.2019.03.003

    PubMed

  10. MUC1-C Integrates Chromatin Remodeling and PARP1 Activity in the DNA Damage Response of Triple-Negative Breast Cancer Cells.

    Yamamoto M, Jin C, Hata T, Yasumizu Y, Zhang Y, Hong D, Maeda T, Miyo M, Hiraki M, Suzuki Y, Hinohara K, Rajabi H, Kufe D

    Cancer research   Vol. 79 ( 8 ) page: 2031-2041 - 2041   2019.4

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:AMER ASSOC CANCER RESEARCH  

    The oncogenic MUC1-C protein is overexpressed in triple-negative breast cancer (TNBC) cells and contributes to their epigenetic reprogramming and chemoresistance. Here we show that targeting MUC1-C genetically or pharmacologically with the GO-203 inhibitor, which blocks MUC1-C nuclear localization, induced DNA double-strand breaks and potentiated cisplatin (CDDP)-induced DNA damage and death. MUC1-C regulated nuclear localization of the polycomb group proteins BMI1 and EZH2, which formed complexes with PARP1 during the DNA damage response. Targeting MUC1-C downregulated BMI1-induced H2A ubiquitylation, EZH2-driven H3K27 trimethylation, and activation of PARP1. As a result, treatment with GO-203 synergistically sensitized both mutant and wild-type BRCA1 TNBC cells to the PARP inhibitor olaparib. These findings uncover a role for MUC1-C in the regulation of PARP1 and identify a therapeutic strategy for enhancing the effectiveness of PARP inhibitors against TNBC.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3259

    Web of Science

    PubMed

  11. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment.

    Ding L, Shunkwiler LB, Harper NW, Zhao Y, Hinohara K, Huh SJ, Ekram MB, Guz J, Kern MJ, Awgulewitsch A, Shull JD, Smits BMG, Polyak K

    PLoS genetics   Vol. 15 ( 3 ) page: e1008002   2019.3

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1371/journal.pgen.1008002

    PubMed

  12. KDM5 Histone Demethylase Activity Links Cellular Transcriptomic Heterogeneity to Therapeutic Resistance.

    Cancer cell   Vol. 35 ( 2 ) page: 330-332 - 332   2019.2

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.ccell.2019.01.012

    PubMed

  13. KDM5 Histone Demethylase Activity Links Cellular Transcriptomic Heterogeneity to Therapeutic Resistance.

    Hinohara K, Wu HJ, Vigneau S, McDonald TO, Igarashi KJ, Yamamoto KN, Madsen T, Fassl A, Egri SB, Papanastasiou M, Ding L, Peluffo G, Cohen O, Kales SC, Lal-Nag M, Rai G, Maloney DJ, Jadhav A, Simeonov A, Wagle N, Brown M, Meissner A, Sicinski P, Jaffe JD, Jeselsohn R, Gimelbrant AA, Michor F, Polyak K

    Cancer cell   Vol. 34 ( 6 ) page: 939-953.e9 - 953.e9   2018.12

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.ccell.2018.10.014

    PubMed

  14. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.

    Ben-David U, Siranosian B, Ha G, Tang H, Oren Y, Hinohara K, Strathdee CA, Dempster J, Lyons NJ, Burns R, Nag A, Kugener G, Cimini B, Tsvetkov P, Maruvka YE, O'Rourke R, Garrity A, Tubelli AA, Bandopadhayay P, Tsherniak A, Vazquez F, Wong B, Birger C, Ghandi M, Thorner AR, Bittker JA, Meyerson M, Getz G, Beroukhim R, Golub TR

    Nature   Vol. 560 ( 7718 ) page: 325-330 - 330   2018.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1038/s41586-018-0409-3

    PubMed

  15. ATR inhibition controls aggressive prostate tumors deficient in Y-linked histone demethylase KDM5D International journal

    Komura Kazumasa, Yoshikawa Yuki, Shimamura Teppei, Chakraborty Goutam, Gerke Travis A, Hinohara Kunihiko, Chadalavada Kalyani, Jeong Seong Ho, Armenia Joshua, Du Shin-Yi, Mazzu Ying Z, Taniguchi Kohei, Ibuki Naokazu, Meyer Clifford A, Nanjangud Gouri J, Inamoto Teruo, Lee Gwo-Shu Mary, Mucci Lorelei A, Azuma Haruhito, Sweeney Christopher J, Kantoff Philip W

    JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION   Vol. 128 ( 7 ) page: 2979 - 2995   2018.7

     More details

    Language:Japanese   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    Epigenetic modifications control cancer development and clonal evolution in various cancer types. Here, we show that loss of the male-specific histone demethylase lysine-specific demethylase 5D (KDM5D) encoded on the Y chromosome epigenetically modifies histone methylation marks and alters gene expression, resulting in aggressive prostate cancer. Fluorescent in situ hybridization demonstrated that segmental or total deletion of the Y chromosome in prostate cancer cells is one of the causes of decreased KDM5D mRNA expression. The result of ChIP-sequencing analysis revealed that KDM5D preferably binds to promoter regions with coenrichment of the motifs of crucial transcription factors that regulate the cell cycle. Loss of KDM5D expression with dysregulated H3K4me3 transcriptional marks was associated with acceleration of the cell cycle and mitotic entry, leading to increased DNA-replication stress. Analysis of multiple clinical data sets reproducibly showed that loss of expression of KDM5D confers a poorer prognosis. Notably, we also found stress-induced DNA damage on the serine/threonine protein kinase ATR with loss of KDM5D. In KDM5D-deficient cells, blocking ATR activity with an ATR inhibitor enhanced DNA damage, which led to subsequent apoptosis. These data start to elucidate the biological characteristics resulting from loss of KDM5D and also provide clues for a potential novel therapeutic approach for this subset of aggressive prostate cancer.

    DOI: 10.1172/JCI96769

    Web of Science

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    PubMed

  16. ER Stress Signaling Promotes the Survival of Cancer "Persister Cells" Tolerant to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors International journal

    Terai Hideki, Kitajima Shunsuke, Potter Danielle S, Matsui Yusuke, Quiceno Laura Gutierrez, Chen Ting, Kim Tae-jung, Rusan Maria, Thai Tran C, Piccioni Federica, Donovan Katherine A, Kwiatkowski Nicholas, Hinohara Kunihiko, Wei Guo, Gray Nathanael S, Fischer Eric S, Wong Kwok-Kin, Shimamura Teppei, Letai Anthony, Hammerman Peter S, Barbie David A

    CANCER RESEARCH   Vol. 78 ( 4 ) page: 1044 - 1057   2018.2

     More details

    Language:Japanese   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    An increasingly recognized component of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) involves persistence of a drug-tolerant subpopulation of cancer cells that survive despite effective eradication of the majority of the cell population. Multiple groups have demonstrated that these drug-tolerant persister cells undergo transcriptional adaptation via an epigenetic state change that promotes cell survival. Because this mode of TKI drug tolerance appears to involve transcriptional addiction to specific genes and pathways, we hypothesized that systematic functional screening of EGFR TKI/transcriptional inhibitor combination therapy would yield important mechanistic insights and alternative drug escape pathways. We therefore performed a genome-wide CRISPR/Cas9 enhancer/suppressor screen in EGFR-dependent lung cancer PC9 cells treated with erlotinib + THZ1 (CDK7/12 inhibitor) combination therapy, a combination previously shown to suppress drug-tolerant cells in this setting. As expected, suppression of multiple genes associated with transcriptional complexes (EP300, CREBBP, and MED1) enhanced erlotinib/THZ1 synergy. Unexpectedly, we uncovered nearly every component of the recently described ufmylation pathway in the synergy suppressor group. Loss of ufmylation did not affect canonical downstream EGFR signaling. Instead, absence of this pathway triggered a protective unfolded protein response associated with STING upregulation, promoting protumorigenic inflammatory signaling but also unique dependence on Bcl-xL. These data reveal that dysregulation of ufmylation and ER stress comprise a previously unrecognized TKI drug tolerance pathway that engages survival signaling, with potentially important therapeutic implications.Significance: These findings reveal a novel function of the recently described ufmylation pathway, an ER stress survival signaling in drug-tolerant persister cells, which has important biological and therapeutic implications. Cancer Res; 78(4); 1044-57. ©2017 AACR.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1904

    Web of Science

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  17. MUC1-C Induces PD-L1 and Immune Evasion in Triple-Negative Breast Cancer.

    Maeda T, Hiraki M, Jin C, Rajabi H, Tagde A, Alam M, Bouillez A, Hu X, Suzuki Y, Miyo M, Hata T, Hinohara K, Kufe D

    Cancer research   Vol. 78 ( 1 ) page: 205-215 - 215   2018.1

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:AMER ASSOC CANCER RESEARCH  

    The immune checkpoint ligand PD-L1 and the transmembrane mucin MUC1 are upregulated in triple-negative breast cancer (TNBC), where they contribute to its aggressive pathogenesis. Here, we report that genetic or pharmacological targeting of the oncogenic MUC1 subunit MUC1-C is sufficient to suppress PD-L1 expression in TNBC cells. Mechanistic investigations showed that MUC1-C acted to elevate PD-L1 transcription by recruitment of MYC and NF-kappa B p65 to the PD-L1 promoter. In an immunocompetent model of TNBC in which Eo771/MUC1-C cells were engrafted into MUC1 transgenic mice, we showed that targeting MUC1-C associated with PD-L1 suppression, increases in tumor- infiltrating CD8(+) T cells and tumor cell killing. MUC1 expressionin TNBCs also correlated inversely with CD8, CD69, and GZMB, and downregulation of these markers associated with decreased survival. Taken together, our findings show how MUC1 contributes to immune escape in TNBC, and they offer a rationale to target MUC1-C as a novel immunotherapeutic approach for TNBC treatment. (C) 2017 AACR.

    DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1636

    Web of Science

    PubMed

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Research Project for Joint Research, Competitive Funding, etc. 1

  1. Mechanism for synthetic lethality in SWI/SNF-deficient breast cancers

    2019.8 - 2021.3

    Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) 

      More details

    Grant type:Competitive

KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research) 7

  1. がん免疫療法における耐性化機序と進化軌跡の解明

    Grant number:22K18381  2022.6 - 2025.3

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(開拓)

    日野原 邦彦

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    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\26000000 ( Direct Cost: \20000000 、 Indirect Cost:\6000000 )

    本研究では、1つの細胞を転写ランドスケープレベルで追跡可能な発現型バーコード技術を利用し、ACTに対する固形がんの耐性化過程を追跡する。ACT過程における個々のがん細胞の運命を発現型バーコード情報から1細胞レベルで空間的に明らかにし、ACTに対する耐性進化軌跡の時空間的な理解を図る。多様性を示す個々のがん細胞の免疫応答に関する機能的な境界を高解像度で解明することに挑戦し、ACT耐性細胞の発生起源とその維持に関わる制御機構を突き止めることを目指す。

  2. エピゲノムダイナミクスに基づくがん多様性の新たな理解

    Grant number:20KK0184  2020.10 - 2023.3

    科学研究費助成事業  国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

    日野原 邦彦, 小嶋 泰弘, 加藤 真一郎

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\18720000 ( Direct Cost: \14400000 、 Indirect Cost:\4320000 )

    本研究課題では、クロマチン制御因子SWI/SNF複合体の遺伝子変異によって生じるエピジェネティクス制御機構の破綻が、発がん、治療耐性、再発といった悪性形質獲得に至る過程においてどのようにがん細胞の多様性を造出し、悪性化進展基盤を成すのかを1細胞エピゲノム解析技術によって解き明かす。1細胞エピゲノム情報を取り入れた統合解析を推進することにより、遺伝的要因とは異なるエピゲノム制御の側面からがん多様性の新たな理解を試み、エピゲノムのダイナミクスから生み出されるがんの不均一性を制御する革新的方法論の創出を目指す。
    本年度は、海外共同研究者より提供されたARID2欠失変異を持つタキサン系抗がん剤耐性乳がん細胞株を用いて、ARID2への分子的介入(野生型ARID2導入)前後の解析を進めた。バルク細胞集団を用いたChIP-seq解析を行い、野生型ARID2のゲノム結合領域をグローバルに明らかにするとともに、これらの結合領域がARID2変異陽性の薬剤耐性細胞では変化していることを見出した。並行して、バルクレベルでのRNA-seqデータとの統合解析も進め、ARID2の変化に応じたトランスクリプトームの変動とエピゲノム動態との関連性を見出しつつある。さらに、海外共同研究者の技術支援のもと、ARID2への分子的介入前後における1細胞単位のエピゲノムとトランスクリプトームの情報を、1細胞ATAC-seq及び1細胞RNA-seqにより取得した。現在、海外共同研究者と連携してこれらのデータ解析を進めているが、初期解析からはARID2のon/offによってエピゲノム・トランスクリプトームともに変化を起こすことを見出しているため、今後より詳細なクラスターレベルでの解析を進めていく予定である。一方、ARID2野生型メラノーマ(悪性黒色腫)細胞株の解析からは、ARID2の欠損により黒色調を呈する細胞から白色調の無色素性細胞へと劇的に変化することを見出した。この変化はメラノーマ細胞から産出されるメラニン色素の量的変化を意味するものであるが、今後この変化がメラノーマ悪性化の観点からどのような意義を持つのかについて検証を進めていく予定である。
    当初の計画に沿って、海外共同研究機関の技術指導のもと、ARID2のレスキュー細胞株モデルを用いた1細胞およびバルクレベルのエピゲノム・トランスクリプトーム解析を実施することができた。初期解析からはARID2のon/offによるこれらの表現型の変化が見てとれたため、来年度以降、1細胞RNA-seq・ATAC-seqのさらに詳細な解析を進めることで、トランスクリプトーム・エピゲノム変化の対応関係を明らかにするための実験データ準備が整ったと言える。また、メラノーマモデルにおいてもARID2レスキューモデル構築およびその解析に関して順調に成果が得られており、今後乳がんモデルとの類似性または差異を調べる環境を整えることができた。一方で、海外渡航制限により海外共同研究機関に赴くことができなかったことから、特に1細胞関連の実験を現地でのハンズオンで進めることができなかった。しかしながら、これらの状況を打破するためのオンラインハンズオントレーニングの体制を整えることができたことは当初予定していなかった成果であり、ポストコロナ時代における新たな海外との連携体制として今後も活用していきたいと考えている。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    今後は、上記にて取得した乳がんの1細胞データを元に、それぞれのクラスター(細胞集団)構造を解明し、クラスターごとのエピゲノム状態とトランスクリプトームの対応関係を明らかにする。これにより、ARID2変異による新規クラスターの生成消失や、クラスターに属する細胞の量的・質的変化により引き起こされるエピゲノム・トランスクリプトームの多様性動態を捉えることを目指す。以上より、ARID2の変化がいかにしてエピゲノムのダイナミクスを規定しているかを理解し、これらの変化が多くの乳がん患者における抗がん剤耐性化の過程で発生するメカニズムに迫りたい。また、これらの乳がん細胞における知見をメラノーマにおいても検証することで、異なるコンテクストにおけるARID2の機能的意義を紐解く。加えて、ARID2欠損による黒色調から白色調へのメラノーマ細胞の色素変化を規定する分子機構を解明するため、色素産生能に関わることが予想されるメラノーマのマスター転写因子MITFのゲノム結合領域をARID2 on/offの条件下にて比較検討する。以上のアプローチによって、ARID2を起点として誘発される各悪性形質がどのようなメカニズムを介して誘導されているのかについて異なる角度から包括的に解明する。
    データ解析については、海外共同研究者によるオンラインハンズオンでの指導体系を構築しているため、リモートで包括的解析手法を学ぶことで研究を推進する。昨今のコロナ禍の事情を鑑み、海外共同研究機関への訪問が実現可能となれば現地にて実験を進めていく予定だが、海外渡航が制限されている状況が長引く場合には、海外機関との連携をオンラインにて密に行い、海外研究者の指導のもと実験と解析を予定通り推進していくことを計画している。

  3. Deciphering mechanisms of immune escape by single-cell barcoding

    Grant number:20K21542  2020.7 - 2022.3

    Grants-in-Aid for Scientific Research  Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

    Hinohara Kunihiko

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\6500000 ( Direct Cost: \5000000 、 Indirect Cost:\1500000 )

    Most human tumors are composed of genetically and phenotypically heterogeneous cancer cell populations that pose a major challenge for the clinical management of cancer patients. Here we used mouse model of adoptive T cell transfer (ACT) to investigate the impact of tumor heterogeneity on therapy effectiveness. We found that all tumors underwent regressions after transfer of tumor antigen-specific cytotoxic T cells but eventually some tumors re-start to grow. We observed that resistance can occur either by selection of pre-existing mERK2-negative clones or via evolution from initially mERK2-positive drug-sensitive cells. Also, we developed single-cell lineage tracing system using expressed DNA barcoding technology to further understand evolutionary trajectory of drug-resistant cancer cells. By utilizing this experimental system, we will identify key roles for intratumor heterogeneity and tumor evolution in ACT response.

  4. がん免疫療法への応用を目指したがん細胞特異的なSTINGアゴニスト輸送体の同定

    Grant number:20K21553  2020.7 - 2022.3

    科学研究費助成事業  挑戦的研究(萌芽)

    北嶋 俊輔, 日野原 邦彦

      More details

    Authorship:Coinvestigator(s)  Grant type:Competitive

    細胞質内二本鎖DNAセンサーSTING経路を刺激するSTINGアゴニストは、がん細胞や免疫細胞に対して抗ウイルス応答を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。これまでに申請者は、STINGアゴニストの細胞内への取り込み様式ががん細胞と免疫細胞で大きく異なり、がん細胞では同じがん細胞株内であっても、STINGアゴニストの取り込みが単一細胞ごとに大きく異なることを明らかにした。そこで本研究では、STINGアゴニストに対する反応性の有無を基準とした単一細胞解析を行い、これまでに全く見つかっていない、がん細胞において機能的に発現するSTINGアゴニスト輸送体を同定することを目的とする。
    これまでに研究代表者は、がん細胞において細胞質内二本鎖DNAセンサーであるSTING経路が抑制されることにより、がん特異的抗原提示能の低下や腫瘍組織浸潤リンパ球の減少につながり、免疫チェックポイント阻害薬に対する治療抵抗性に寄与することを明らかにした。そこで、がん細胞自身を標的としたSTING経路活性化が、がん免疫療法抵抗性を克服するための治療戦略として有効であると考え、本研究では、これまでにほとんど明らかになっていない細胞内在性STINGアゴニスト2’3’cGAMP(以降cGAMP)の輸送体を同定することを目的とする。
    ① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析
    本年度は、主に単一細胞解析に使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の検討を詳細に行った。STING経路が抑制されていることが報告されている種々のヒト由来の肺がん細胞株、大腸がん細胞株、メラノーマ細胞株を用いて、細胞外にcGAMPを投与したところ、H1944やH2122、H647、A375株などのヒトがん細胞株において、cGAMP投与後3-6時間程度でSTING経路が活性化することを明らかにした。STING経路の活性化には細胞外に分泌されるSTING下流サイトカインCXCL10の濃度をELISAにより評価した。また細胞外に添加するcGAMPの濃度を検討し、投与条件の最適化を行った。
    ② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化
    単一の細胞を転写ランドスケープレベルで追跡するための実験系最適化を行った。発現バーコードライブラリを用いて、A375株を含む複数のがん細胞を一細胞レベルでラベルし、10x Genomics社の1細胞解析キットにてトランスクリプトーム情報とバーコード情報を同時取得するための実験系と解析系の構築を進めた。
    2020年度の研究実施計画は主に「① cGAMP処理前後での遺伝子発現変動解析」および「② 単一細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化」であった。
    ①に関しては、これまでに研究代表者らやその他のグループから、肺がん細胞や大腸がん細胞、メラノーマ細胞などでSTING経路が抑制されることが報告されており、2020年度はこれら既報の細胞株を用いて、単一細胞解析を行うための細胞外cGAMP投与の最適化を行った。単一細胞間での感受性の差異を検出するため、CXCL10の発現上昇を指標として、短期間かつ低濃度で明確なSTING活性化が観察される条件を検討した。具体的には、細胞株ごとに多少の違いはあるものの、約5-10 mg/mlのcGAMPで3-6時間刺激を行うことが最適であると決定した。本年度は、最適化した条件を用いて、実際に単一細胞発現解析を実施する予定であるが、使用するための細胞株の選定とcGAMP処理条件の最適化という2020年度の研究目標に関しては、おおむね順調に達成したと考えられる。
    ②に関しては、主に発現バーコードライブラリのウイルス感染条件最適化とバーコード化細胞の1細胞解析予備実験を行った。細胞ごとに異なるバーコードで標識するため、MOI0.1にてレンチウイルス感染を行い、その後GFPソートすることで複数のバーコード化細胞を樹立した。予備検討として10xによる1細胞解析を行い、データからトランスクリプトーム情報に加えてバーコード情報を取り出す解析手法の確立を進めている。以上より、1細胞解析用バーコード化標識を実施するための条件最適化という2020年度の研究目標に関して、おおむね順調に達成したと考えられる。
    ① バーコードライブラリーを用いた細胞標識:昨年度に投与条件の最適化を行ったヒトがん細胞株を用いて、RNA型発現バーコードあるいは必要に応じてDNA型バーコードにより標識する。発現バーコードライブラリレンチウイルスをMultiplicity of infection 0.1で感染させ、単一細胞ごとに1万種類の異なる発現バーコードで細胞を標識する。
    ② cGAMP処理前後での単一細胞レベルでの遺伝子発現変動解析:cGAMP未処理あるいは3時間処理したバーコード化済み細胞株からそれぞれRNAを回収した後、10xGenomicsを用いた単一細胞RNAシークエンスにより、バーコード情報と遺伝子発現プロファイルを同時に読み取る。10xGenomicsデータはパイプラインCell Rangerにて解析し、tSNEもしくはSPADEにより可視化することによって2’3’cGAMP処理前後による遺伝子発現変化を単一細胞レベルで捉える。
    ③ cGAMP輸送体候補遺伝子の抽出と機能解析:様々なSTING標的遺伝子を含むGene set「STING SIGNATUR」を用いて、cGAMP処理前後におけるエンリッチメントスコアの変動を計算し、単一細胞レベルでcGAMPに対する反応性の高低による順位付けを行う。次に、刺激前における発現量が反応性と正に相関する遺伝子群を抽出する。次に、CRISPR/Cas9系を用いて候補遺伝子の欠損細胞を作製し、細胞外cGAMPに対する反応性を検討する。STING活性化マーカーとしてCXCL10の分泌亢進をELISAにより測定する。コントロール実験として、トランスフェクションによるcGAMP導入を実施し、候補遺伝子が膜輸送体を介したcGAMP取り込み特異的に作用するか否かを検討する。

  5. 膠芽腫における合成致死性メカニズムの解明

    Grant number:20H03512  2020.4 - 2023.3

    科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    日野原 邦彦

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\17810000 ( Direct Cost: \13700000 、 Indirect Cost:\4110000 )

    悪性脳腫瘍である膠芽腫に対する治療薬は現在のところアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)のみであり、そのTMZに対しても最終的に耐性が出現することから、その克服や新規治療法の開発が喫緊の課題である。本研究では、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングによりATRX変異陽性膠芽腫のアキレス腱を発見し、新規合成致死性メカニズムに基づいた新たな治療選択肢の創出を目指す。加えて、ATRX変異によるエピジェネティック変化が細胞のトランスクリプトーム多様性に影響し、それによって膠芽腫の進展や薬剤耐性が誘導されるという新たな仮説を検証する。
    本年度は、昨年度までに樹立した3つのドキシサイキリン誘導性ATRXノックアウト細胞株を用いて、ゲノムワイドCRISPR loss-of-functionスクリーニングを実施した。これらの細胞株を用いたスクリーニングは、ATRXノックアウト下のみならず、現在膠芽腫唯一の治療薬となっているアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)の投与下においても実施した。まずこれら3種の細胞株にCRISPR H3ライブラリを感染させ、十分にATRXノックアウトによる影響が出るように、ドキシサイクリン+/-およびTMZ+/-の条件下でそれぞれの細胞株を3週間培養した。その後DNA抽出を行い、CRISPRライブラリ部分をPCRにて増幅して次世代シークエンス解析を行なった。CRISPR解析用パイプラインであるMAGeCKFluteを用い、negative selectionから合成致死性遺伝子候補、positive selectionから治療抵抗性遺伝子候補の抽出を試み、ATRXノックアウトとTMZ投与下において合成致死性・治療抵抗性を示す因子をそれぞれ複数同定することに成功した。今後これら候補因子の個別ノックアウト株を樹立してスクリーニングのバリデーションを進めることで、新規合成致死性療法の開発と薬剤耐性メカニズムの解明につながる研究成果が得られることが期待される。一方、ATRXによるエピゲノム制御機構を明らかにするため、樹立したATRXノックアウト細胞株を用いてChIP-seq解析も行い、ATRX特異的なゲノム結合領域を明らかにした。また、TMZに対する薬剤耐性化過程の細胞進化軌跡の解明に向け、モデル細胞株を用いたバーコード技術の開発・最適化を進めた。
    昨年度に樹立したCas9安定発現株を用いたATRXノックアウトの系を応用し、Cas9をドキシサイクリン誘導性のiCas9へと変更して再度誘導性ノックアウト細胞株を3種類樹立することができたため、これらを対象としたゲノムワイドCRISPR loss-of-functionスクリーニングを実施した。また、当初計画には含めていなかった、TMZ投与下におけるスクリーニングも3種類全ての細胞株で並行して進めることができた。CRISPR解析用パイプラインであるMAGeCKFluteを用いたデータ解析も特段の問題なく順調に進んだ。スクリーニングのデータ解析結果からは、合成致死性・薬剤耐性に関わる候補因子群の両方で非常に興味深い遺伝子群が釣れてきており、来年度に実施予定の個別バリデーションの結果から有望な治療標的を発見することが期待できる。また、ATRXノックアウトの系を用いたChIP-seq解析から、ATRX特異的なゲノム結合領域とノックアウトによるその減弱が明らかとなったことから、RNA-seqおよびATAC-seqを追加実施してATRXによるエピゲノム制御機構を包括的に明らかにするための実験系を整えることができたと言える。また、TMZに対する薬剤耐性化過程における細胞の進化軌跡の解明研究に関するバーコード技術の準備は順調に進み、モデル細胞株を用いた予備検討からバーコードライブラリウイルスのクオリティと耐性化実験及び解析パイプラインがワークすることを確認できた。以上のように、当初の研究計画はおおむね順調に進展している。
    本年度に実施したゲノムワイドCRISPR loss-of-functionスクリーニングから得られた候補因子群には興味深い標的が複数含まれていたため、今後これら候補因子の個別ノックアウト株を樹立してスクリーニングのバリデーションを進めることで、ATRX変異陽性膠芽腫に対する新規合成致死性療法のシーズ同定へと歩を進める。また、TMZ投与後にenrichしたsgRNAsの解析を詳細に進めることで、TMZに対する新たな薬剤耐性化メカニズムの解明につながる研究成果を得ることを目指す。一方、本年度はATRXのグローバルなゲノム結合領域を明らかにすることができたことから、今後RNA-seqやATAC-seqとの統合解析を進め、ATRXのon/off条件下における遺伝子発現変動やクロマチンのオープン・クローズ状態を理解することで、ATRXによるエピゲノム制御機構を明らかにしていく。加えて、上記のCRISPRスクリーニングにて実施したTMZ投与の系を利用し、細胞バーコード化技術を用いた薬剤耐性化過程における進化軌跡の解明研究を進めていく予定である。バーコードによる細胞系譜追跡から薬剤耐性化メカニズムを1細胞レベルで解明し、CRISPRスクリーニングから得られる薬剤耐性化メカニズムと併せて統合的な理解を図ることで、TMZに対する薬剤耐性の根幹を成すバイオロジーを明らかにする。以上のような複数のアプローチを組み合わせることにより、ATRX変異陽性膠芽腫に対する新たな治療法の開発と、現在唯一の治療薬であるTMZに対する薬剤耐性化を克服する治療法の確立を目指す。

  6. The evolutional trajection and precision-medicine to gliomas

    Grant number:20H03789  2020.4 - 2023.3

    Grants-in-Aid for Scientific Research  Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

      More details

    Authorship:Coinvestigator(s)  Grant type:Competitive

  7. Mechanism for synthetic lethality in SWI/SNF-deficient breast cancers

    2019.8 - 2021.3

    Japan Agency for Medical Research and Development  Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) 

      More details

    Grant type:Competitive

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