Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\4680000 （ Direct Cost: \3600000 、 Indirect Cost：\1080000 ）

細胞分裂で生じた娘細胞同士の位置関係が永続的に維持される植物では、細胞分裂面の制御は器官の形を決める上で決定的な意味を持つ。植物の細胞分裂においてはPPBと呼ばれる細胞表層の微小管束構造が分裂面制御において中心的な役割を担うと考えられて来たが、近年シロイヌナズナの変異体解析からPPBに依存しない分裂面制御機構の存在が示唆された。。本研究では、PPB非依存的な細胞分裂をするヒメツリガネゴケを用いて網羅的に細胞分裂面制御因子を解析することで、植物が細胞分裂面を決定づける普遍的な分子機構の解明に挑む。
細胞分裂で生じた娘細胞同士の位置関係が永続的に維持される植物では、細胞分裂面の制御は器官の形を決める上で決定的な意味を持つ。植物の細胞分裂においてはPPBと呼ばれる細胞表層の微小管束構造が分裂面制御において中心的な役割を担うと考えられて来た。一方、ヒメツリガネゴケの原糸体にはPPBが存在せず、分裂面決定の仕組みもあまりよく分かっていない。近年、シロイヌナズナの変異体解析からPPBに依存しない分裂面制御機構の存在が示唆された。このことはPPB非依存的な機構が植物の分裂面決定機構としてより根源的なものである可能性を示唆する。本研究では、細胞生物学的解析に秀でたヒメツリガネゴケとCRISPRによるゲノム編集技術を組み合わせ、網羅的に細胞分裂面制御因子を解析することで、植物が細胞分裂面を決定づける普遍的な分子機構の解明に挑む。
ゲノム編集技術による遺伝子破壊操作によって候補因子の多重遺伝子破壊株を複数樹立した。中には細胞分裂面形成異常を想起させる興味深い表現型を示す個体もあった。これらがどう分裂面決定に関与しているのかは今のところ不明であるが、マーカータンパク質やトランケーションタンパク質、阻害剤等を使ったイメージング解析によって詳細な分子メカニズムの解明を目指す。
また、シロイヌナズナ受精卵を用いたスクリーニングで同定された阻害剤の細胞分裂に関する効果検証も行った。中には細胞質分裂を特異的に阻害する薬剤もあり、見いだされた阻害剤はヒメツリガネゴケでも、シロイヌナズナで確認されたものと同様の効果を示すことが確認できた(Kimata et al., 2023. Life Sci Alliance) 。
細胞質分裂を特異的に阻害する薬剤の効果をヒメツリガネゴケでも検証し、論文として発表したため。また、細胞分裂面決定に関わっていることが予想される候補因子の多重遺伝子破壊株を樹立し、興味深い表現型を見出したため。
見出した候補因子の作用機序の解明を目指して、進行中の表現型解析やドメイン解析を継続する。

Authorship：Principal investigator  Grant type：Competitive

Grant amount：\2860000 （ Direct Cost: \2200000 、 Indirect Cost：\660000 ）

細胞内の物質輸送を司る細胞内輸送は細胞にとって必須機能であり、細胞骨格と分子モーターにより制御される。輸送モーターがカーゴ（積荷）に付属した特異的なアダプタータンパク質を認識して結合することで、精密に制御された細胞内物質輸送が可能となる。しかし、植物ではアクチンによる原形質流動が主要な細胞内輸送機構だと考えられてきたため、生理的に重要であるにも関わらず、微小管依存的な細胞内輸送の分子機構には未解明な部分が多く残されている。本研究では、基部陸上植物であるヒメツリガネゴケを用いた逆遺伝学的スクリーニングにより微小管依存的な細胞内輸送のカーゴアダプター及び順行性輸送モーターの同定を目指す。
細胞内輸送はアクチンや微小管といった細胞骨格と細胞骨格に付随するモータータンパク質によって駆動される細胞機能の維持に必須な物質輸送機構である。小胞やオルガネラ、タンパク質、RNA等がカーゴ（積荷）として輸送されることが知られており、輸送モーターがカーゴに付属した特異的なアダプタータンパク質を認識して結合することで、精密に制御された物質輸送が可能となる。しかし、その生理的な重要性に関わらず、植物の微小管依存的な細胞内輸送の分子機構には未解明な部分が多い。そこで、遺伝学的ツールの利用が可能であり、顕微鏡観察に適した細胞を持つ基部陸上植物ヒメツリガネゴケ(Physcomitrium patens)を用いて研究を行った。本研究では1)輸送モーターに認識されるアダプタータンパク質の探索、2)輸送モーターとアダプタータンパク質を繋ぐKLC（kinesin light chain）の機能解析、3)順行性輸送モーターの同定、の3点を目指した。
2019年度は、ヒメツリガネゴケに存在する既知の輸送モーターであるKCBP（VI型kinesin-14）のドメイン解析を行い、輸送に必要となるドメインの同定を目指した。その結果、FERMドメイン、MyTH4ドメインを欠失したコンストラクトではKCBP KO株の表現型がレスキューされないことを見出した。この結果は、FERMドメイン、MyTH4ドメイン両方がKCBPキネシンの輸送機能に重要であることを示唆している　（Yoshida et al., Cell Struct Function.）。現在は、この結果をもとにスクリーニング系の立ち上げを行っており、アダプタータンパク質の探索を継続中である。
2020年4月から５月にかけて、新型コロナウイルス感染拡大防止を目的として、大学で研究環境の制限が設けられたため研究時間を大幅に削減せざるを得ず、ほとんど実験が実施できなかった。その後、５月末から１月中頃まで出産休暇と育児休暇を取得し、研究を約７ヶ月中断した。そのため、本年度はほとんど研究テーマの進捗が得られなかった。
産休育休取得による研究期間の延長を申請したため、当初より１年遅れで研究計画を遂行する予定である。具体的には、本年度はドメイン解析の結果をもとにアダプタータンパク質の探索を続けると同時に、進行中のKLC (kinesin light chain)の機能解析実験を継続する。