担当区分：研究代表者 

配分額：6370000円 （ 直接経費：4900000円 、 間接経費：1470000円 ）

主要イネ科作物のイネとトウモロコシを用いて以下の研究を行う。イネでは、野生型と液胞膜型K+トランスポーター変異体を用い、変動光条件を作り出した人工気象室で、水管理システムを用いてポット栽培を行う。イネのOsNHX1発現、光合成特性、水利用効率を評価し、NHX1遺伝子が気孔開閉速度および水利用効率の向上を通じて、節水性に寄与する可能性を検証する。トウモロコシでは、K施肥量に応じた気孔開閉速度と水消費量の関係を解析する。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて孔辺細胞・副細胞の3次元形態を解析する。これらの研究を通じて、迅速な気孔開閉が作物の節水性に寄与する可能性を検証する。
マイクロコントローラー (Arduino Mega, ESP32) を駆使し、1システムあたり最大18の植物を栽培したポット重量を自動制御かつ水消費量のリアルタイムモニタリングが可能なローコスト・ハイスループットシステムを開発した。本システムを用いて主要なC3・C4作物を一定の乾燥条件を維持して栽培し、SEM-EDSによる細胞内の元素分析、携帯型ガス交換測定装置による個葉レベルの光合成・蒸散計測、個体レベルの水利用効率の評価を組み合わせることで、これら主要作物の乾燥条件に対する応答を評価した。
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イネにおいては、気孔の孔辺細胞におけるカリウムイオン輸送体が気孔開閉に果たす役割に着目し、野生型と同遺伝子の変異体を変動光・乾燥条件下で栽培した。予想に反し、野生型と同変異体は湛水条件と乾燥条件ともに、上述の特性に明確な差は見られなかったが、細胞から個体レベルで一貫した結果が見られたことから、一連の測定手法の妥当性が示された。
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その他のダイズやトウモロコシなどの主要なC3・C4畑作物においては、カリウムが迅速な気孔開閉に寄与することで水利用効率が向上する可能性を検証した。本システムを用いて一定の乾燥条件を維持して栽培した結果、いくつかの作物種では、カリウム欠乏条件下で気孔閉鎖が抑制されることで、水利用効率が低下した。また、カリウム高施肥により、特に乾燥条件下で水利用効率の低下が緩和する可能性が示唆された。
今回開発したマイクロコントローラー制御型の水管理システムは、最大18個のポットの重量を個別に高精度に制御できるだけでなく、Wi-Fi通信機能を内蔵しており、計測データをGoogleスプレッドシートに自動転送することで、研究室だけでなく、遠隔地からでもリアルタイムに全てのデータを確認できるようになった。このシステムは、環境制御されたグロースチャンバーだけでなく、より自然に近い環境条件を再現できるガラス温室内でも安定して稼働し、多様な実験条件下で植物の水利用特性を評価できる、非常に汎用性の高いシステムとして完成した。
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本システムの導入により、主要なC3作物（イネ、コムギ、ダイズ）とC4作物（トウモロコシ、ソルガム、シコクビエ）の水利用特性に関する大規模な比較解析が効率的に行えるようになり、研究が大幅に進展した。さらに、シロイヌナズナでの利用を想定した小型システムも開発し、様々な遺伝子変異体の乾燥ストレス応答の表現型解析にも着手している。これにより、乾燥耐性に関わる遺伝子の機能解明や、乾燥ストレス耐性機構の分子メカニズムの解明に繋がることが期待される。
本システムを大量製作・導入し、主要なC3・C4作物に加え、様々な作物種の乾燥条件下での水利用特性を解析する。これにより、様々な遺伝的背景を持つ作物における乾燥ストレス応答の多様性を明らかにし、普遍的な乾燥耐性・適応メカニズムの解明に貢献する。
得られた大規模データから、乾燥耐性・適応に関連する形質を網羅的に探索する。特に、気孔開閉速度、葉・茎・根の通水性、根系形態などの水分生理・形態的特性に着目し、乾燥ストレスに対する応答パターンを詳細に解析する。これらの解析を通じて、乾燥耐性・適応に重要な形質を特定し、その遺伝的基盤を解明する手がかりを得る。
さらに、シロイヌナズナの関連遺伝子変異体を用いた詳細な解析を行う。本システムで特定された乾燥耐性・適応に関わる変異体を用いて、乾燥条件下での表現型を詳細に解析する。これにより、各遺伝子の機能を明らかにし、乾燥耐性・適応メカニズムにおける役割を解明する。

担当区分：研究代表者 

配分額：18980000円 （ 直接経費：14600000円 、 間接経費：4380000円 ）

イネのさらなる多収化のためには、群落レベルのソース能・シンク能とその気象応答を正確に理解する必要がある。本研究では、マイコンベースのIoTデジタルデバイスを駆使し、イネ群落レベルのソース能、シンク能、およびそれらの気象応答を非破壊的・連続的に評価可能なローコスト・ハイスループットな新規評価システムを開発する。新規イネ多収系統を用いた日本4地点の連絡試験を通じてその有用性と汎用性を実証し、気候変動下の作物生産の向上に貢献する。

担当区分：研究分担者 

（ 直接経費：1000000円 ）

日本においてダイズの耐湿性の向上は，未だ解決されていない長年の課題である．過湿ストレス下において植物の根は真っ先にその影響を受ける器官であることから，耐湿性向上には過湿ストレスに適応できる根系を育種する必要がある．そこで，植物の根が過湿ストレス後の根系形成過程を、これまでのような形態的な特徴だけではなく，①植物体内の生理応答、②根系の再構築，③根系機能の回復の3段階に分けて解析を行い，ダイズの過湿ストレスに対する根系形成を理解する．さらにこれらの情報を利用して，CIRADにおける海外共同研究者と連携して過湿ストレスに対するダイズの根系形成モデルを構築することで，根型育種における問題解決に挑む．
令和2年度の日本におけるダイズは飼料用も含めるとわずか6%程度となっている．ダイズの生産性が向上しない要因の一つに過湿ストレスが挙げられる．日本においてダイズの耐湿性の向上は，未だ解決されていない長年の課題である．植物の根は，養水分の吸収を担う重要な器官であるとともに，湿害，旱害，塩害，貧栄養などの環境ストレスに真っ先に晒される器官であることから，作物はこのようなストレスに適応するために根系の再構築を行う．そのため，植物が環境ストレス耐性を獲得するためには，根系の改良が重要であり，第二の緑の革命は根型育種において起こると期待されている．そのため，耐湿性向上においても過湿ストレスに適応できる根系を育種する必要がある．そのためには，過湿ストレスに対する根系形成を理解し，根系形成モデル構築し，根型育種のための明確なストラテジーの確立が必要不可欠である．これまでに過湿ストレス下において，根系形態の変化よりもはるかに早く炭素動態を変化させていることから，2023年度はダイズ幼苗期をモデルに植物の生理応答と炭素動態について詳細な解析を行った．その結果，ダイズは過湿ストレス後1時間以内に炭素動態を大きく変化させていることが明らかとなった．また，CIRADにおいて海外共同研究者と連携して制御環境下で複数のダイズ品種を栽培し，過湿ストレスに対する根系形態を解析した．
本年度，ダイズ幼苗を使用した放射性同位体を用いた実験から過湿ストレス後に根における炭素動態が1時間以内に大きく変化したことが明らかとなった．同様に地上部の光合成活性や糖濃度を測定したが，これらについては24時間以内に大きな変化は観察されなかった．したがって，新規固定炭素の動態が，過湿ストレスに応答して大きく変化しており，早期のストレス応答の指標となることが明らかとなった．さらにPETISを用いた解析から，遅くとも処理後20分後には過湿ストレス下において根の炭素の輸送が大きく抑制される可能性があることが明らかとなった．また，フランスのCIRADにおいてRhizoscopeを用いた解析を行いダイズ6品種を低酸素および酸素十分条件下で栽培し，光合成活性や根系形態および地上部形質を測定したところ品種間差を検出できた．
昨年度までで，ダイズ幼苗期における過湿ストレスに応答した，根系形態とその炭素動態に関するデータについては十分に取得することができた．しかし，低酸素処理を施しているものの，実際に根に酸素が全く輸送されていないのか，あるいはされていたとしてもどの程度酸素が根に供給されているかなどの情報が不足している．そこで，次年度は円筒型酸素電極を用いて，過湿ストレス下で根にどの程度酸素が供給されているかについて評価する．また，過湿ストレス下の根の応答として主根の伸長停止がある．過湿ストレス下の根系形態の変化は，主根根端が傷害を受けたことが要因となっている可能性があることからこのことについても検証する必要がある．これらの生理学的，形態学的データを蓄積した上でCIRADの共同研究者と根系形態のモデリングを行う予定である．また，昨年度フランスのCIRADにおいてRhizoscopeを用いた解析を行い品種間差を検出することには成功した．しかし，低酸素処理区と酸素十分な環境との間で，明確な生育の差を検出できなかった．これは施設内の光が強く過湿ストレスの影響が低減されてしまったことが要因であると考えられる．今年度についても，この問題を解決し1ヶ月間CIRADでのダイズ栽培を行う予定である．

担当区分：研究分担者  資金種別：競争的資金

これまでに、ジャポニカ品種T65と比較してインディカ（aus）品種であるDV85は出穂時に茎葉部NSC含量が高く、出穂後にNSCおよび茎葉部乾物重が急速に減少し、穂重は急速に増加するという登熟様式を示すことを明らかにし、関与するQTLとしてqNSC1、qNSC2、qSWTR11を見出した。また、T65と高収量品種の北陸193号（H193）の交雑後代によるQTL解析では、H193の高いバイオマス生産性に関与するQTLとしてqPW1を、二次枝梗の種子稔性に関与するQTLとしてqPF_SB10を見出した。これらのQTLを多面的に評価して登熟能・実際の収量との関連を解析する。
ジャポニカ品種T65とインディカ品種DV85では、登熟時の茎葉重の変化や茎葉部に蓄積される非構造正炭水化物（NSC）の動態が大きく異なる。これまでに、これらの形質に関与する量的形質遺伝子座（QTL）を両系統の交雑に由来する組換え自殖系統で検出した（Phung et al. 2019）。本研究はこれらのQTLを均一な遺伝的背景をもつ染色体部分置換系統（TD-CSSL）で評価し、QTLの原因遺伝子単離を目指している。
TD-CSSLの形質評価の結果、精もみ収量に対して、シンク容量（すべての穎花が登熟した場合の収量）・充てん率（実際の玄米重／すべての穎花が登熟した場合の玄米重）・バイオマス（穂重+茎葉重）・種子稔性（登熟歩合）などに正の相関が見られた。また、シンク容量に対し、充てん率および種子稔性は負の相関を示した。充てん率と種子稔性の相関は高かった（R=0.76, p=0）。充てん率とバイオマス、充てん率と粗もみ重の間には相関がなかった。また、玄米の粒厚と充てん率には正の相関（R=0.51, P<0.001）があった。TD-CSSLの評価で計測に手間がかかる充てん率を評価するには、種子稔性や粒厚の測定が有用であることが明らかとなった。
また、TD-CSSLの遺伝子型をgenotyping by sequencingにより決定し、登熟期間中のNSC量や茎葉重の減少に関与する既報のQTL（Phung et al. 2019）との照合を行ったが、TD-CSSLに導入されたDV85由来の染色体領域との単純な一致は見られなかった。NSCについては解析途中であり、さらに検討を進める。
北陸193号が出穂期にNSCを茎葉部にT65よりも多く蓄積することを確認し、この原因となりうるQTLを染色体11に検出した。
材料の育成では、TD-CSSLからQTLのピラミディング系統の作出と高精度連鎖解析向けの分離集団の作出を行った。
本研究では、T65と比較した場合のDV85の高いの充てん率に関与するQTLの候補として、出穂期のNSC蓄積に関与するqNSC1、登熟期の茎葉部のNSC減少に関与するqNSC2、登熟期の茎葉部の乾物重減少に関与するqSWTR11などの効果の確認を目的にTD-CSSLの形質評価を行っており、やや遅れ気味ではあるが、実験の進捗は順調である。また、NSC測定に関しては、従来の粉砕装置では処理速度・騒音の問題があり律速となっていたが、新たな方法を導入してスピードアップできた。また、交配によるピラミッド系統の作出やTD-CSSL由来の分離集団の作出も順調に行った。ただし、2022年の田植え時期の酷暑による活着不良でイネの成育が不均一となり、実験結果に影響があった可能性があり、一部で再度の実験を要する。
NSCの動態に関しては、qSWTR11が導入されているCSSLで茎葉重の減少は顕著ではなかったが、出穂期の高NSC、登熟期のNSC減少が見られた。このことは、染色体11に登熟期間中のNSC動態に関与する遺伝子が存在することを示唆した。これについて、重点的に解析をすすめ、充てん率に影響があるかどうかを確認する。また、最終的な収穫期だけでは登熟能の評価は困難であることは明らかであり、登熟の途中である出穂20日後のサンプルを利用し、登熟・種子充てんの速度が評価できないかを検討する。この場合、単純な重さだけでなく、未熟粒の比率を穀粒判別機により測定するなど、より登熟の動態を詳細に調査する実験系を確立する必要がある。

担当区分：研究分担者 

（ 直接経費：100000円 ）

イネの体内特に茎部の炭素源を利用したエンドフィティック窒素固定システムのメカニズムの解明と固定能の向上のため、不伸長茎部の窒素固定を促進する菌叢や基質、酸素条件をnifH発現、菌叢解析、メタボローム解析などから明らかにする。またイネへの15N2供与実験系を開発し、ホストとエンドファイト間での炭素・窒素のやりとりの動態を解明する。さらにアフリカイネ品種などを用いて窒素固定能力向上のために有効なＱＴＬの解析を行うとともに、固定能を促進する土壌環境や土壌改良資材を遊離酸化鉄などに着目して解析する。
イネの体内特に茎部の炭素源を利用したエンドフィティック窒素固定システムのメカニズムの解明と固定能の向上のため、茎部の窒素固定に関与する代謝産物を解析した。ＡＲＡ（アセチレン還元活性）が異なる３品種・系統について２段階の窒素レベルで水田で栽培し、茎部を採取した後メタボローム解析を行った。メタボローム解析から得られた代謝産物濃度とARAの関係から窒素固定に関与している代謝産物を推定した。その結果、スクロースなどの糖類がもっともＡＲＡと相関が高かった。さらにその影響を検証するために、新鮮茎部サンプルにこれらの基質の添加してＡＲＡの促進効果を調査した。その結果糖類によるＡＲＡの促進を観察した。またその際に発生するCO2やCH4とＡＲＡの間には必ずしも関係は見らなかった。このことは基質の分解に伴う窒素固定の炭素の利用効率は基質や環境、品種その他の要因で変動することが推察された。さらに窒素固定化性の高かったアフリカイネ(O.glaberrima)品種の遺伝要因を明らかにするためにアフリカイネ/アジアイネ(O.sativa)品種の２組の染色体断片置換系を圃場栽培し、ＡＲＡで評価した茎部窒素固定能力に関与するＱＴＬ領域の推定を行った。その結果複数の染色体領域に窒素固定能の向上関与するQTLが存在する可能性を示した。
これまで茎部窒素固定能と糖類濃度に関係のあることから、糖類による窒素固定の促進を推察してきた。今回はメタボローム解析による網羅的な代謝産物の解析から茎部窒素固定に関与する代謝産物の候補を明らかにすることができた。また活性が比較的高いアフリカイネを用いた遺伝解析によって遺伝要因を推定することができた。
代謝産物との関係解析に加えてさらに茎部の微細部位別の窒素固定菌叢を解析するとともにその基質要求性を明らかにする。特に活性が高いと推定される不伸長茎部など茎基部のうち窒素固定の高い部位とその菌叢や基質要求性を詳細に調査することで茎部窒素固定の全体像を明らかにしようとする。
また根圏土壌における窒素固定についてもその促進要因を明らかにするために、酸化鉄などの影響を解析する。光合成窒素固定とヘテロトロフ窒素固定のそれぞれについて酸素の影響も含めて調査する。

担当区分：研究分担者  資金種別：競争的資金

イネ葉鞘の塩排 除能の分子機構と塩害下での生理的意義の解明を目的とし、CRISPRによるゲノム編集や過剰 発現などの遺伝子改変技術を用いて、これまでに見出した塩輸送体遺伝子や転写因子の候補遺 伝子から実際に葉鞘の塩排除に関わる遺伝子を同定する。また、QTL解析を行い葉鞘の塩排 除能の品種間差に関わる遺伝子座を同定し、遺伝的背景が同一でQTLのみ異なる残余自殖系統を作製して、葉鞘の塩排除能が塩害下のイネ生産性の維持にどのように寄与するかを調べる。
イネ葉鞘の塩排除能の分子機構と塩害下での生理的意義の解明を目的とし、CRISPRによるゲノム編集や過剰発現などの遺伝子改変技術を用いて、これまでに見出した塩輸送体遺伝子や転写因子の候補遺 伝子から実際に葉鞘の塩排除に関わる遺伝子を同定する。また、QTL解析を行い葉 鞘の塩排 除能の品種間差に関わる遺伝子座を同定し、遺伝的背景が同一でQTLのみ異なる残余自殖系統を作製して、葉鞘の塩排除能が塩害下のイネ生産性の維持にどのように寄与するかを調べることが目的である。
まずCRISPOR-Cas9によるノックアウト変異株作出用コンストラクトを作製した。その後アグロバクテリウムに形質転換し、イネカルスに感染させた。しかしその後再分化個体を得ることができなかった。また、HKT1;1, HKT2;1, NHX1, Jumonji遺伝子のTos17挿入株の表現型解析の結果では、現在までにNHX1ノックアウト株が葉鞘の塩排除能の減少する表現型を示している。その他はデータのばらつきが大きく、まだ葉鞘の塩排除能への変化の有無は結論付けられない。
次に、Chop-qPCR法を用いて塩応答する塩輸送体遺伝子群、および塩応答性転写因子遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化程度を調べた。現在までに調べたほとんどの遺伝子について、発現量の変化とDNAメチル化程度の変化に関係は見られなかった。
さらに、ノナボクラ/コシヒカリCSSLのうち、SL502, 536とコシヒカリのF2個体を用いたQTL解析では、栽培・収穫が終わった。SL509とコシヒカリのF2集団は作製した。またQTL集積を見越したSL502とSL509の交配を行い、F１種子を得た。さらに、残余自殖系統の作製のため、IR-44595と318を用いたF5系統より、QTL-seq解析用系統の作出に成功した。また、QTL集積系統の作出にも成功した。
特に葉鞘の塩排除関連候補遺伝子群の過剰発現株、ノックアウト変異株の作出に遅れが生じている。CRISPR-Cas9用コンストラクトを作製し、アグロバクテリウムに形質転換してイネカルスに感染させた。しかし現在までに再分化個体を得ていない。再分化個体が得られるにはカルス誘導からもう一度行う必要があり、予定より遅れている。さらに、Tos17挿入株の表現型解析においても、個体間のばらつきが大きく、十分に結論付けることができなかったため、表現型解析も再度行う必要がある。これらの理由から、予定よりもやや遅れている。
本研究課題は、当初申請した方策で進めていく。ただし現在遅れている理由についての方策として、まず葉鞘の塩排除関連候補遺伝子群の過剰発現株、ノックアウト変異株の作出の遅れについては、再分化誘導に用いる試薬、特に植物ホルモンをもう一度作り直し、再分化誘導を試みる。またCRISPR-Cas9コンストラクトを用いない野生型イネカルスをポジティブコントロールとして用い、作製した試薬の質をチェックする。
次に個体間のばらつきが大きく結論付けることのできなかった表現型解析については、扱う個体数を増やし、環境のばらつきも考慮した実験計画法（乱塊法）を用いて再度表現型解析を行う。

担当区分：研究分担者 

樹木の衰退や枯死は、森林動態の終着点であるとともに再生を促す出発点ともなる現象である。近年、報告されている温暖化による森林衰退の原因解明とあわせて、樹木が衰退し、枯死していくプロセスの解明は将来的な地球規模の気候変動を予測するための重要な情報となる。本研究は、師部・木部を介した物質輸送の制約を考慮して、師部輸送の下流にあたる「幹の基部や根といった器官で深刻な炭水化物制限が起き、これが衰退や枯死の原因になる」、という局所的炭水化物制限説を提唱する。そして、亜高山帯の常緑針葉樹林でみられる「縞枯れ」で、ここに生える常緑針葉樹のシラビソの健全個体と衰退個体を使い、仮説を検証する。
本研究では、樹木の衰退や枯死の原因が、根や幹の基部といった師部を通るショ糖輸送の下流で深刻な炭水化物制限が起きることによる、という局所的炭水化物制限説の検証を目的としている。本年度は、（１）師部輸送によるショ糖供給量と茎や根の成長の個体内の分布を定量するためのHPLCによる糖の定量、（２樹皮、木部、葉における非構成炭水化物（NSC）の測定、（３）同位体を用いた師部輸送速度の推定方法の検討、（４）師部の解剖学的解析のための切片の作製方法の検討、（５）個体の生産・枯死の状態判別のための蒸散流速測定を試みた。
全体として測定は一進一退で手法の検討に多くの時間を費やした。（１）HPLCによる糖の定量では、当初、島津製のカラムを使って糖とギ酸の反応を利用した方法を使ったが、時間がかかる上に扱いが難しく安定した測定結果を得られなかった。（２）分担者の杉浦氏がNSCの測定を行ったが、グルコースやスクロース量が個体の部位によって大きく変化するなど解釈の難しい結果を得た。（３）従来13CO2を植物に取り込ませることで、師部での同位体の移動を見る。しかし、この方法は大掛かりな装置と長い時間を必要とするが、ヒマワリを使った実験から15Nが小さな傷から素早く師部に取り込まれることを明らかにした。（４）従来は長期間の有機溶媒の浸透など煩雑な手順で切片が作られていたが、cryo-statを使って凍結した樹皮で切片を作製することで、比較的容易に観察に耐える切片を得られるようになった。（５）樹液流速は幹に穴をあけてプローブを差し込んで測定を行う方法が主流であるが、この方法をシラビソで試すと木部が乾燥して正しい測定値が数週間で取れなくなることが分かった。
安定した測定を行うためには、測定手法の検討を必要とする項目が多くあり、今年度は主にこれらの試行錯誤に時間を費やしたため。
今年度は、昨年度の試行錯誤で得た情報を使って測定方法の改良を行い、安定した測定ができることを目指す。具体的には以下の項目を計画している。（１）Shodex製のカラムと示差屈折率検出器での測定に変えることで、測定時間を今までの1/3、簡便な操作で測定ができるようにする、（２）NSCの測定では、貯蔵物質であるデンプンの定量を主な目的とする、（３）樹皮に傷をつけて15Nを取り込ませ、師部の輸送速度の推定方法を確立させる、（４）個体内の師部形態の変化を健全個体と衰退個体について定量する、（５）蒸散流測定では、分担者の宮沢氏が植物表面に貼り付けるタイプのセンサーの開発を進めており、これを実際に試す、（６）ルートメッシュ法を用いた根の成長量を推定する。

担当区分：研究代表者 

配分額：17940000円 （ 直接経費：13800000円 、 間接経費：4140000円 ）

イネ群落の様々な分光反射特性から、群落成長および生理特性の日変化を連続・非破壊的に測定する手法を開発し、様々な品種特性の微気象応答性から収量決定要因までを、定量的に解明することを目的とする。現在の気候条件下における現行イネ品種の栽培適性地や収量ポテンシャルの評価、将来の気候変動環境下でより高成長・収量を示すイネ品種デザインの提示といった、データ駆動型の育種・品種選定が可能になることが期待される。

担当区分：研究分担者 

茎部NSCと窒素固定の関係を詳細に解析するとともに菌の基質利用性、酸素要求性の解明により窒素固定活性の促進を図る。多様な品種に加えて近年開発されてきている、茎部のNSC蓄積を増大させた変異体や組換え体も活用しながら炭素基質の供給の増強により窒素固定能力が高まるかを検証するとともに、有効な菌叢を明らかにする。さらにイネーエンドファイト間での光合成産物の動態や有効な菌叢の特性の解析ならびに窒素固定活性を向上させるために有用な遺伝要因、栽培条件を明らかにすることでイネの窒素獲得能のポテンシャルの向上を試みる。
圃場試験において高NSC蓄積性の多収品種やインディカ・ジャポニカ品種（Oryza sativa L.）およびアフリカイネ(O glaberrima Steud.)を含む多様な品種・系統について茎部の窒素固定活性を比較した。調査は活性が高まると考えられる幼穂形成～出穂期を中心に窒素固定活性をアセチレン還元活性（ARA）により評価することで行った。その結果、ARAには品種間差異が認められ、アフリカイネCG14など窒素固定ポテンシャルの高い品種を明らかにした。これらの品種では遊離糖が高い傾向にあった。さらに遊離糖の影響を検証するためADPグルコースピロホスホリラーゼ（AGP）遺伝子のひとつOsAGPL1のTos17挿入変異により茎部にデンプンを蓄積せず遊離糖を高集積する変異体（Agpl1）について親品種（日本晴）とARAをポット試験および圃場試験により比較した。その結果、親品種よりARAが高い傾向にあることを認めた。さらに遮光処理によって糖蓄積を低下させるとARAも低下した。これらの結果から、茎部への糖蓄積がARAに強く影響することを明らかにした。ただしこれらの糖が直接窒素固定菌の基質になるかどうかについては今後検討していく必要がある。
また日本晴やagpl1、CG14、およびデンプンを高集積するリーフスターについて茎部の全菌叢および窒素固定菌の菌叢をそれぞれ16sRNA、nifHのアンプリコン解析により解析した。その結果16sRNA、nifHともに品種や系統によって特有の菌叢を持つことを示した。nifHの解析結果より窒素固定菌としては好気性菌、嫌気性菌が存在するが前者が主体である可能性を示した。
ほぼ予定通りに茎部の窒素固定ポテンシャルの高い品種・系統を明らかにすることができた。品種間差異の要因としてはNSC特に遊離糖の蓄積特性がARAと関係することが示唆されたため、Agpl1を用いて親系統との比較によって遊離糖の影響の検証を行った。またARAの異なる品種、系統については菌叢解析を行い、窒素固定菌についても品種、系統によって特有の菌叢をもつことを示すことができた。
これまでに茎部の窒素固定活性（アセチレン還元活性；ARA）が標準品種「日本晴」より高まる傾向が認められた高糖蓄積性のアフリカイネ品種CG14や「日本晴」変異系統について、窒素獲得能力への寄与を評価するために窒素施肥反応や低窒素適応性を調査する。また生育期間中の体内の炭素動態と窒素固定活性との関係を解析する。遮光試験によって遊離糖の低下が間接的にARAに影響する可能性も示されたため、今後遊離糖以外の代謝産物についてもより広範囲にARAとの関係を解析することが有用と考えている。また品種、系統の窒素固定ポテンシャルを引き出すために多様な土壌条件がイネ体のARAに及ぼす影響を解析する。さらに窒素固定活性の高いモデルイネの作出を目指して細胞間隙中の糖濃度を高める組替え系統について、ARAの高い系統を選抜、絞り込むとともにその特性の詳細を解析する。

担当区分：研究分担者 

本申請研究では、節水条件において高い生産性を示す植物の創成を目指す。その第一段階として、クロロフィル蛍光と葉温の可視化技術を組み合わせることによって、光合成速度と蒸散速度を同時評価し、植物の水利用効率の可視化を試みている。本年度、光化学系Ⅱにおける電子伝達の実効量子収率 (ΦPSⅡ) を蛍光画像より可視化する二次元クロロフィル蛍光装置を構築し、プログラミング言語Pythonを活用し、上記のイメージングおよび数値解析を全自動で行う独自プログラムを構築した。これによって、光合成活性の迅速な定性・定量解析が可能となった。
また、植物の水利用効率の遺伝的改良に向けた基盤研究を行った。作物が灌漑水の節減条件下で高い生産性を示すためには、植物自身の水分吸収能力や吸水量あたりの光合成能力 （つまり、水利用効率）を高めることが必要である。水利用効率に影響を及ぼす要因の一つとして、細胞間隙から葉緑体にかけてCO2の通りにくさ（つまり、葉肉抵抗）を挙げることができる。本年度は、国際共同研究先のEvans研究室（オーストラリア国立大）に赴き、高性能レーザー分光装置を用いて、葉肉抵抗を評価した。その結果、葉肉抵抗、光合成速度と蒸散速度の変動する光に対する挙動を世界で初めて捉えることに成功した。
さらに、申請者らがこれまで得た研究成果に伴って、シロイヌナズナにおいてPATROL1が節水条件における物質生産能力の強化に有効なターゲットとなるかを検証した。本研究成果によって、PATROL1遺伝子をシロイヌナズナにおいて過剰発現すると、水利用効率を高く保ったまま、植物成長速度が向上することを新たに明らかにし、PATROL1が水利用効率の向上のターゲットになることを世界に先駆けて証明した（Kimura et al., 2020, J. Exp Bot.）。
クロロフィル蛍光と葉温の可視化技術を組み合わせることによって、光合成速度と蒸散速度を同時評価し、植物の水利用効率の可視化を試みている。これまでに、光化学系Ⅱにおける光合成電子伝達のパラメータを蛍光画像より可視化する二次元クロロフィル蛍光装置を構築した。今後、蒸散速度を正確に可視化することのできる装置を構築し、それと二次元クロロフィル蛍光測定装置とを組み合わせ、さらに、水利用効率の可視化を全自動で行うプログラムを開発することによって、水利用効率の新規可視化装置の構築を試みたい。
また、植物の水利用効率の遺伝的改良に向けた基盤研究を行った。これまでに、シロイヌナズナにおいて、気孔開閉の制御に関与すると報告されているPATROL1の水利用効率に関する機能を解明し、PATROL1が灌漑水の節減条件下における物質生産能力の強化に有効なターゲットとなることを示した。PATROL1遺伝子と非常に似た遺伝子がイネやソルガムなどの作物やポプラなどの樹木にも存在しているため、これらの植物においても過剰発現体によるバイオマス増産に期待できる。そこで、今後、PATROL1遺伝子を過剰発現した形質転換体イネを材料に、、PATROL1が水利用効率に及ぼす影響を調べる予定である。
乾燥ストレスが過酷にならない程度の水資源制限下で、高い水利用効率を実現する植物創成を手掛けた例は極めて少ない。今後、灌漑水を節減した条件下で、生産性を維持・向上する節水型農業が求められるため、植物の水利用効率の向上に関する研究は必須である。そこで、本申請研究では、節水条件において高い生産性を示す植物の創成を目指す。2020年度は引き続き、水利用効率の可視化装置の構築に向け、クロロフィル蛍光測定装置から光合成に関する各パラメータの可視画像を自動で出力するようにプログラムを修正し、大規模スクリーニングにも適用できるように改変する。また、赤外線サーモグラフィによる可視画像の出力も行えるようにプログラムを作製する。可視化装置の構築が終われば、変異体リソースの迅速スクリーニングにより、水利用効率の向上に関する新規遺伝子の探索を開始する。
また、植物の水利用効率の遺伝的改良に向けた基盤研究も行う。これまでに水利用効率向上の具体例として、気孔開閉の制御に関与すると報告されているPATROL1の水利用効率に関する機能を解明してきた。今後、乾燥ストレスや高温ストレスをかけた際の光合成や水利用効率の挙動を解析し、PATROL1が節水条件における物質生産能力の強化に有効なターゲットとなるかを検証する。また、イネにおいてPATROL1を高発現することによって、節水条件における物質生産能力の強化に有効なターゲットとなるかも同様に検証する。

担当区分：研究分担者 

野外での日々の微気象環境の変化がイネの水や養分の輸送を担う各種遺伝子群の発現におよぼす影響と、それらの遺伝子の応答性の生理的な役割について調べた。アクアポリン（生体膜の水やCO2輸送を担うたんぱく質）の蒸散要求量の変化に対する発現応答が、栽培方法や生育ステージの違いに関わらず普遍的に観察された。また葉に発現している約半数の遺伝子の発現量が、蒸散要求量に応じて変化していることが示された。イネの水利用効率の品種や大気CO2濃度に対する変化や、土壌水分の低下によるイネの生理応答の解析から、微気象環境の変化に対する遺伝子の発現応答が、植物の生育戦略上で重要な役割を持っている可能性が示唆された。
植物の生育は多数の遺伝子によって調整されているが、植物が生育する野外では、光環境や気温・湿度、地温などの複数の環境がさまざまな時間スケールで複雑に変化する。野外で生育してるイネを対象として、水や養分の輸送を担う各種遺伝子の状態と生育状態の変化を調べたところ、イネは日々の蒸散要求量や土壌水分などの微気象環境の変化に応じて、それら遺伝子の発現量をダイナミックに変化させ、自らの水輸送や養分吸収、光合成などの機能を柔軟に調節している可能性が示された。これは植物の生存戦略において重要な調節機能であり、気候変動下における作物の安定生産技術を構築する上で役立つ基礎的な知見である。

担当区分：研究代表者 

配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）

マメ科作物やイネにおける、個葉光合成や群落成長の微気象応答およびその品種間差の解明を目的として研究を行った。ダイズやインゲンを用いた研究では、葉に蓄積する非構造性炭水化物による個葉光合成ダウンレギュレーションの生理メカニズムの種間差を明らかにした。群落成長の指標であるLAI（葉面積指数）の非破壊測定法の開発に取り組んだ研究では、イネ群落内外の微気象観測・分光計測から、移植から登熟期までのLAIを連続かつ非破壊的に推定可能になった。この手法を用い、イネ群落成長の微気象応答の品種間差・地域間差を解析する手法までを確立できた。
植物の物質生産の基盤である光合成の調節機構の生理メカニズムや種間差、群落レベルの成長量の非破壊測定法を確立できたことで、野外環境における微気象が植物の光合成や成長に与える影響を容易に評価できるようになった。これらの研究成果は、将来環境において、大気CO2濃度の上昇や温暖化が作物の生産性に与える影響を予測することに役立つことが期待される。

植物体の光合成産物のシンク活性に対して、光合成器官である葉のソース活性が過剰なとき、葉に非構造性炭水化物 (TNC、デンプンや可溶性糖) が蓄積すると、光合成速度が低下する現象は、光合成ダウンレギュレーションとして知られている。しかし、その詳細なメカニズムや種間差、生態学的意義については不明な点が多かった。本研究ではこれらの問題を解決するために、以下の実験を行った。
アブラナ科植物5種、マメ科植物3種を用いた環境操作実験を行い、TNCが光合成速度に与える影響を評価した。その結果、TNCの蓄積による光合成速度の低下は、マメ科植物のインゲンのみにおいてしか見られなかった。
ダイズとインゲンを用いた詳細な比較実験から、シンク・ソース比の減少に応じて、葉にTNCだけでなく、細胞壁などの構造性炭水化物も蓄積することが分かった。そこで、細胞壁量の増加が細胞壁厚さによるものであれば、葉内から葉肉細胞内へのCO2透過性（葉肉コンダクタンス）も減少していると仮説を立て、炭素安定同位体方による葉肉コンダクタンスの測定と、透過型電子顕微鏡による細胞壁厚さの解析を行った。その結果、両種において、シンク・ソース比の減少に応じて細胞壁厚さが3倍近く増加していた。さらに、葉肉コンダクタンスと細胞壁量・厚さの間には明確な負の相関がみられた。
これらの結果から、シンク・ソース比の減少に応じた光合成ダウンレギュレーションにおいては、ルビスコなどの光合成タンパク質の減少による生理学的な調節だけでなく、細胞壁厚さの増加による形態的な調節も行われていることが示された。

担当区分：研究代表者 

配分額：2730000円 （ 直接経費：2100000円 、 間接経費：630000円 ）

植物は個体レベルの葉、茎、根への炭水化物 (C) や窒素 (N) の分配や、葉の面積あたりの重さ (LMA) を、環境条件に応じて変化させる。本研究では、このようなC・N分配パターンや、LMAを調節するメカニズムについて、植物ホルモンであるジベレリン (GA) やサイトカイニン (CK) の役割や、シンクソースバランスに応じて葉に蓄積する糖が果たす役割を解明することを目的として行った。
(1) 草本植物イタドリ (Polygonum cuspidatum) を用いて、光やN条件の変化に応じた個体レベルのC分配の変化と、内生GAやCKの変化の関係を解析した。強光・弱光の各条件下では、高N条件ほど、地上部全体のCK濃度が高く、同時に個体レベルの葉へのC分配比も高かった。活性型GA濃度も同様に高N条件ほど高く、強光・低N条件ではほとんど検出されなかった。外生GA、CK添加時に見られる葉へのC分配比と、内生GA、CK濃度が高いときに見られる葉へのC分配比は同様の傾向を示すため、これらの植物ホルモンが個体レベルのC分配の変化を調節するメカニズムに深く関わっていることが示唆された。
(2) 草本植物ダイコン (Raphanus sativus) の、胚軸が肥大する品種 (コメット：貯蔵シンク活性が高い) と肥大しない品種 (葉大根：活性が低い) を接ぎ木することでシンクソースバランスを変化させ、葉へ蓄積する糖がLMAや葉の構造に与える影響を評価した。どちらの品種でも、貯蔵シンク活性が低い葉大根の胚軸を台にすると、シンク活性が高いコメットを台にした時と比べ、LMAが大幅に増加した。増加分はデンプンだけでは説明できず、葉の厚さはほとんど変化していなかったため、デンプンが蓄積するほど細胞壁成分が増加している可能性が示された。葉の横断切片の構造解析を行ったところ、細胞数や細胞密度がデンプン量に応じて変化していることが分かった。
翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

植物個体レベルの葉/根比(L/R)、葉の厚さ(LMA)や葉面積あたりのN濃度(Narea)などの炭素(C)・窒素(N)分配パターンは、光環境に応じた葉のN需要および土壌からのN供給に応じて、相対成長速度(RGR)を最大化させるように調節されていることが示唆されている(Sugiura & Tateno 2011)。本研究では、このような環境変化に応じたCN分配パターンを制御するメカニズムについて、植物ホルモンの役割に焦点を当て、(実験1)外生植物ホルモンの添加実験、(実験2)環境変化に応じた内生植物ホルモンの定量的解析、を行なった。
(実験1)において、外生植物ホルモンとして、ジベレリン(G,GA3)、サイトカイニン(B,ベンジルアデニン)、ジベレリン合成阻害剤(U,ウニコナゾール)を用い、これらを単体、または組み合わせて植物体全体に添加する実験を行った。これらの植物ホルモン処理によって、個体レベルでの葉面積あたりの葉の重さ(LMA,gm-2)やL/Rが大きく変化した。また、このような形態的特性の変化と連動して葉のNareaが変化し、光合成速度や純生産速度といった生理的特性が変化した。個体全体のRGRは主に形態的特性の変化で説明されたことから、環境変化に応じたこれらの植物ホルモンによる形態的特性の制御によって、RGRが決定されていることが示唆された。
(実験2)では、イタドリを、コントロール群は3段階のN条件(HN、MN、LN)で生育させたのち、HNはさらに摘葉(Def)、低N(LowN)、弱光(LowL)処理をし、1週間生育させた。これらのグループごとに、葉位ごとの、生理的形質、CN含量、バイオマス分配、内生の植物ホルモン量(GAs:ジベレリン、CKs=サイトカイニン、IAA:オーキシン)の測定を行った。コントロール群では、N条件が高いほど葉/根比が大きく、GAs量も高かった。処理群では、Def、LowL、LowNの順に、葉へのバイオマス分配比が大きいほど、GAs重も高かった。これらの結果からも、植物体はN条件や光条件の変化に対して、内生植物ホルモンの量を変化させることで葉根比を調節している可能性が示唆された.