国名：日本国

国名：日本国

国名： 日本国

担当区分：研究代表者 

配分額：4810000円 （ 直接経費：3700000円 、 間接経費：1110000円 ）

脳幹聴覚回路は、音が左右の耳に到達する際の1ミリ秒にも満たないわずかなずれ（両耳間時差）を検出して音源定位に寄与する。鳥類の脳幹では大細胞核（NM）から層状核（NL）へ投射する軸索が音の周波数ごとに両耳情報を統合するユニークな配線パターンを構築していて、これによって両耳間時差を活動する細胞の場所情報として符号化している。本研究では、in vivoスクリーニングにより両耳間時差検出を支える配線パターンの構築メカニズムにアプローチする。
脳幹聴覚回路は、音が左右の耳に到達する際の1ミリ秒にも満たないわずかなずれ（両耳間時差）を検出して音源定位に寄与する。鳥類の脳幹では大細胞核（NM）から層状核（NL）へ投射する軸索が音の周波数ごとに両耳情報を統合するユニークな配線パターンを構築していて、これによって両耳間時差を活動する細胞の場所情報として符号化している。複雑精緻なこの配線パターンはどのように作られるのだろうか。本研究では、両耳情報の統合を支える側枝形成のしくみと、音の周波数順に規則正しく配線を接続するしくみに焦点を当て、in vivoスクリーニングを重ねることで責任分子を探索し、両耳間時差検出を支える配線パターンの構築メカニズムを明らかにすることを目的とする。
2年目である令和６年度は、エレクトロポレーションによるin vivoノックインの効率化に着手した。従来のプラスミドを導入してCas9とgRNAを発現させる方法では、導入細胞におけるノックインの効率が低く解析に支障をきたすこともあったが、人工合成したCas9とgRNAを直接導入する方法に切り替えることで劇的な導入効率の向上を実現できた。また、ssDNAドナーの自家合成にphospho-PCR法を採用することで、長鎖合成に要するコストの大幅な削減を実現できた。さらに、ノックインによる分子の局在解析と、前年度確立した200um厚スライスの三次元ミクロ形態解析法を組み合わせることで、軸索上の分布が近位から遠位になるにつれて減少するような分子を同定することができた。このような軸索上の分子局在の不均一性は、独立した側枝形成メカニズムが単一NM軸索上の近位と遠位に存在しているという本研究の仮説を支持するものである。
令和6年度は、軸索分子の局在解析に必要なin vivoノックインの効率化を実現できた。加えて、軸索構造の三次元ミクロ形態解析手法を発展させ、軸索に沿ったランビエノード分布の不均一性のメカニズムの一端を明らかにし、論文を出すことができた。さらにこれらの要素技術を組み合わせて、軸索上で不均一な局在を示す分子を同定することができた。これらの点から、当初の計画どおりの進展を遂げていると判断した。
令和7年度は、TRAP-seqの実装を進め、軸索で局所翻訳されるmRNAが近位と遠位でどのように違うのかを調べる。それによって同定された分子の局在をin vivoノックインにより可視化することで、局所翻訳が軸索分子の不均一な分布に寄与しているのかを検証する。また。並行してノックアウトスクリーニングを進め、特徴的な配線パターンを構築する分子メカニズムにアプローチする。

担当区分：研究代表者 

配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）

オリゴデンドロサイトは脳領域ごとに異なる形態や遺伝子発現を示す。このオリゴデンドロサイトの不均一性(heterogeneity)は、両耳間時差を検出する脳幹聴覚回路において左右の耳に入力する音情報の正確な統合に重要であると考えられている。本研究では、申請者が独自に確立したニワトリ胚脳幹聴覚回路における細胞種特異的な遺伝子操作技術と3次元回路形態の定量解析技術を駆使して、オリゴデンドロサイトの領域差が形成される過程を詳細かつ多角的に解析する。さらに機能的介入によりオリゴデンドロサイト不均一性を生み出すメカニズムにアプローチする。
本研究により、脳幹聴覚回路におけるオリゴデンドロサイト形態の領域差を作り出すメカニズムの一端が明らかとなった。神経核近傍領域では、対側投射領域と比較してオリゴデンドロサイト系譜細胞の密度が高く、この細胞密度の領域差は軸索からの開口放出の抑制によってほぼ消失した。また、オリゴデンドロサイトにおけるBDNFシグナリングの操作は領域依存的にミエリン形態に影響を及ぼした。以上の結果は、脳幹聴覚回路の軸索から放出されたBDNFの局所濃度差がオリゴデンドロサイト形態の領域差を生み出す可能性を示唆する。
オリゴデンドロサイト不均一性に関する知見は蓄積しつつある一方で、その機能的意義については十分に理解が進んでいない。本研究では、オリゴデンドロサイト不均一性がマイクロ秒レベルの両耳間時差検出に関わることが示唆される脳幹聴覚回路において、その形成メカニズムの一端を明らかにした。この成果は、神経グリア回路の情報処理基盤を理解するうえで重要な知見となると期待できる。

担当区分：研究代表者 

配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）

発達期の神経回路再編の過程において、シナプス前軸索同士が競合しながら標的細胞との接続を成熟させていく際の基盤原理はまだほとんど理解が進んでいない。本研究では、軸索の標的支配数は競合相手の数に依存するという仮説を実験的に検証するため、シナプス前後の接続関係が発達に伴い1対多から1対1へと収束する毛様体神経節シナプスをモデルとして、シナプス前ニューロン数を遺伝子工学的に間引いた際の軸索の投射パターンを定量的に評価することで、標的支配数が変化するか否かを調べた。その結果、シナプス前ニューロン数を半数程度まで減少させても標的支配数の変化は見られず、シナプス後ニューロンの細胞数が連動して減少した。
発達期における神経回路の再編は、脳の発達の根幹を成す現象の1 つである。学習の臨界期の神経基盤として広く認識されているほか、発達期再編の異常は統合失調症や自閉症、共感覚の原因であるという指摘もされている。本研究で得られた成果は、軸索の標的支配数は競合相手の数ではなく、内因的な分子・細胞メカニズムによって運命づけられている可能性を示唆し、今後のさらなる研究の発展が期待される。