所属
大学院医学系研究科 総合医学専攻 准教授
学部担当
医学部 医学科
職名
准教授
連絡先
クロダ ケイスケ
黒田 啓介
KURODA Keisuke
学位 1
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博士（医学） （ 2011年11月 名古屋大学 ）
学歴 2
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名古屋大学 医学系研究科
2006年4月 - 2010年3月
国名： 日本国
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名古屋大学 医学部 医学科
1998年4月 - 2004年3月
国名： 日本国
論文 21
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Accumbal D2R-medium spiny neurons regulate aversive behaviors through PKA-Rap1 pathway 査読有り 国際誌
Lin, YH; Yamahashi, Y; Kuroda, K; Faruk, O; Zhang, XJ; Yamada, K; Yamanaka, A; Nagai, T; Kaibuchi, K
NEUROCHEMISTRY INTERNATIONAL 143 巻 頁： 104935 2021年2月
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Zhang, XJ; Nagai, T; Ahammad, RU; Kuroda, K; Nakamuta, S; Nakano, T; Yukinawa, N; Funahashi, Y; Yamahashi, Y; Amano, M; Yoshimoto, J; Yamada, K; Kaibuchi, K
NEUROCHEMISTRY INTERNATIONAL 122 巻 頁： 8 - 18 2019年1月
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Dopamine drives neuronal excitability via KCNQ channel phosphorylation for reward behavior 査読有り 国際誌
Tsuboi, D; Otsuka, T; Shimomura, T; Faruk, MO; Yamahashi, Y; Amano, M; Funahashi, Y; Kuroda, K; Nishioka, T; Kobayashi, K; Sano, H; Nagai, T; Yamada, K; Tzingounis, AV; Nambu, A; Kubo, Y; Kawaguchi, Y; Kaibuchi, K
CELL REPORTS 40 巻 ( 10 ) 頁： 111309 2022年9月
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Striatal TRPV1 activation by acetaminophen ameliorates dopamine D2 receptor antagonists-induced orofacial dyskinesia.
Nagaoka K, Nagashima T, Asaoka N, Yamamoto H, Toda C, Kayanuma G, Siswanto S, Funahashi Y, Kuroda K, Kaibuchi K, Mori Y, Nagayasu K, Shirakawa H, Kaneko S
JCI insight 2021年4月
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Sekiguchi, M; Sobue, A; Kushima, I; Wang, CY; Arioka, Y; Kato, H; Kodama, A; Kubo, H; Ito, N; Sawahata, M; Hada, K; Ikeda, R; Shinno, M; Mizukoshi, C; Tsujimura, K; Yoshimi, A; Ishizuka, K; Takasaki, Y; Kimura, H; Xing, JR; Yu, YJ; Yamamoto, M; Okada, T; Shishido, E; Inada, T; Nakatochi, M; Takano, T; Kuroda, K; Amano, M; Aleksic, B; Yamomoto, T; Sakuma, T; Aida, T; Tanaka, K; Hashimoto, R; Arai, M; Ikeda, M; Iwata, N; Shimamura, T; Nagai, T; Nabeshima, T; Kaibuchi, K; Yamada, K; Mori, D; Ozaki, N
TRANSLATIONAL PSYCHIATRY 10 巻 ( 1 ) 頁： 247 2020年7月
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Phosphorylation of Npas4 by MAPK Regulates Reward-Related Gene Expression and Behaviors
Funahashi Yasuhiro, Ariza Anthony, Emi Ryosuke, Xu Yifan, Shan Wei, Suzuki Ko, Kozawa Sachi, Ahammad Rijwan Uddin, Wu Mengya, Takano Tetsuya, Yura Yoshimitsu, Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Amano Mutsuki, Yamada Kiyofumi, Kaibuchi Kozo
CELL REPORTS 29 巻 ( 10 ) 頁： 3235 - + 2019年12月
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Comprehensive analysis of kinase-oriented phospho-signalling pathways 査読有り 国際誌
Amano, M; Nishioka, T; Tsuboi, D; Kuroda, K; Funahashi, Y; Yamahashi, Y; Kaibuchi, K
JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 165 巻 ( 4 ) 頁： 301 - 307 2019年4月
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Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1(Delta 2-3/Delta 2-3) mice
Wulaer B., Nagai T., Sobue A., Itoh N., Kuroda K., Kaibuchi K., Nabeshima T., Yamada K.
GENES BRAIN AND BEHAVIOR 17 巻 ( 8 ) 2018年11月
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Bin Saifullah, MA; Nagai, T; Kuroda, K; Wulaer, B; Nabeshima, T; Kaibuchi, K; Yamada, K
SCIENTIFIC REPORTS 8 巻 ( 1 ) 頁： 14413 2018年9月
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IN VIVO IMAGING FOR THE EFFECT OF COCAINE
Zhu Y., Ito N., Nagai T., Kuroda K., Kaibuchi K., Nabeshima T., Yamada K.
ALCOHOLISM-CLINICAL AND EXPERIMENTAL RESEARCH 42 巻 頁： 28A-28A 2018年8月
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Dopamine-induced phosphorylation of NPAS4 through MAPK regulates reward-related learning and memory
Funahashi Y., Ariza A., Suzuki K., Wei S., Kozawa S., Takano T., Kuroda K., Nagai T., Kaibuchi K.
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY 142 巻 頁： 129-129 2017年8月
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Phosphorylation signals in hippocampal and striatal synapses
Kaibuchi K., Kuroda K., Yoshikawa M.
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY 142 巻 頁： 22-22 2017年8月
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Neuropeptide Y neuronal network dysfunction in the frontal lobe of a genetic mouse model of schizophrenia
Morosawa Shunsuke, Iritani Shuji, Fujishiro Hiroshige, Sekiguchi Hirotaka, Torii Youta, Habuchi Chikako, Kuroda Keisuke, Kaibuchi Kozo, Ozaki Norio
NEUROPEPTIDES 62 巻 頁： 27-35 2017年4月
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RhoA activity regulates spine morphology and memory formation
Nakanose Yuki, Kuroda Keisuke, Zhang Xinjian, Oda Kaishu, Nagai Taku, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 133 巻 ( 3 ) 頁： S160-S160 2017年3月
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The activity-dependent transcription factor NPAS4 regulates reward-related learning and memory
Suzuki Ko, Funahashi Yasuhiro, Ariza Anthony, Wei Shan, Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 133 巻 ( 3 ) 頁： S164-S164 2017年3月
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KANPHOS (Kinase-Associated Phospho-Signaling) Platform - A database for neural phosphoproteomics with quality control
Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Amano Mutsuki, Yoshimoto Junichiro, Kannon Takayuki, Nishioka Tomoki, Usui Shiro, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 133 巻 ( 3 ) 頁： S263-S263 2017年3月
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Dopamine-induced phosphorylation of NPAS4 through MAPK regulates reward-related learning and memory
Yasuhiro Funahashi, Ariza Anthony, Wei Shan, Kozawa Sachi, Okuda Keiichiro, Suzuki Ko, Takano Tetsuya, Yura Yoshimitsu, Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 133 巻 ( 3 ) 頁： S216-S216 2017年3月
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Elevated repetitive and compulsive-like behavior in a schizophrenia animal model
Wulaer Bolati, Nagai Taku, Sobue Akira, Kuroda Keisuke, Kaibuchi Kozo, Nabeshima Toshitaka, Yamada Kiyotumi
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 133 巻 ( 3 ) 頁： S219-S219 2017年3月
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Cell-type-specific isolation of 14-3-3 associated phosphoprotein from complex brain tissues
Yoshikawa Marina, Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 133 巻 ( 3 ) 頁： S159-S159 2017年3月
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Cell-type-specific isolation of 14-3-3 associated phosphoprotein from complex brain tissues.
Yoshikawa M., Kuroda K., Nagai T., Kaibuchi K.
MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL 28 巻 頁： . 2017年
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RhoA activity regulates spine morphology and memory associated behavior.
Kuroda K., Zhang X., Oda K., Nakanose Y., Yoshikawa M., Nagai T., Kaibuchi K.
MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL 28 巻 頁： . 2017年
講演・口頭発表等 2
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Cell-type-specific isolation of 14-3-3 associated phosphoprotein from complex brain tissues
Yoshikawa, M; Kuroda, K; Nagai, T; Kaibuchi, K
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES 2017年3月
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Cell-type-specific isolation of 14-3-3 associated phosphoprotein from complex brain tissues. 国際会議
Yoshikawa, M; Kuroda, K; Nagai, T; Kaibuchi, K
MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL 2017年
科研費 4
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統合失調症治療薬の細胞種特異的な細胞内シグナル解析
研究課題/研究課題番号：20K07965 2020年4月 - 2023年3月
黒田 啓介
担当区分：研究代表者
配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）
脳は、分子・細胞・神経回路・脳・個体にいたる階層性を持つ大規模で複雑なシステムであり、機能解明には脳システムの全体像を捉えながら研究を遂行する必要がある。細胞内シグナル伝達機構を分子レベルで解明することは、脳機能の理解だけでなく、精神神経疾患の病因や病態の解明、治療法の開発に非常に重要である。しかし、脳神経系は部位毎に、機能や構成する細胞、制御する神経伝達物質が異なっており、精神神経疾患の病態解明や新規治療薬開発のためには、細胞種特異的なシグナル解析を個体内で行う必要がある。
本研究では、統合失調症治療薬が脳内で引き起こすリン酸化シグナルを細胞種特異的に解析し薬理作用を明らかにする。 -
個体脳神経回路におけるRhoA Rho-kinase細胞内シグナル伝達機構の解析
研究課題/研究課題番号：18K14816 2018年4月 - 2021年3月
若手研究
黒田 啓介
担当区分：研究代表者
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
細胞内シグナル伝達機構を分子レベルで解明することは生命現象の理解に非常に重要である。しかしながら、脳はヘテロな細胞集団で構成されており、細胞種毎にその細胞内シグナルは異なるため、これまでの神経科学では、これらを個体内で個別に解析することは手間と費用の問題から現実的ではなかった。研究代表者は、細胞種特異的にCreを発現するトランスジェニック（Tg）マウスやアデノ随伴ウイルス（AAV）を組み合わせ、細胞種特異的なシグナル解析を迅速かつ詳細に個体内で行う実験系を確立している。
本研究では、特にRhoファミリー低分子量G蛋白質RhoAおよびその下流分子であるRho-kinaseシグナルについて個体内での細胞内シグナル伝達を解析した。
RhoAおよびRho-kinaseの活性を制御するAAVを作製し、マウス脳側坐核に注入した際の発現を確認した。Rho-kinase（rock1, rock2）のダブルコンディショナルノックアウト（Rock1/2 dcKO）マウスを作製し、交配と繁殖を行った。AAV-RhoA/Rho-kinaseをマウス脳側坐核に注入したマウスや、Rock1/2 dcKOマウスを利用し、記憶に関わる行動実験を行った。いくつかの行動実験にて行動が変化した。
AAV-RhoA/Rho-kinaseを注入したマウスや、Rock1/2 dcKOマウスのシナプス形態を観察し、RhoA, Rho-kinaseシグナルがシナプス形態の制御に関与していることを確認した。
RhoAの活性化因子GEFや不活性化因子GAPについてリン酸化抗体を作製した。行動実験を行ったマウス脳側坐核からタンパク質ライセートを作製し、いくつかのGEFやGAPにおいてリン酸化状態が変化していることを確認した。
これまでに、RhoA, Rho-kinaseシグナルがシナプス形態やマウスの行動に関与していることについてはほぼ確認できている。RhoAの活性はRhoGEFやRhoGAPが制御している可能性が非常に高いことを確認している。
今後は、明らかになった結果についてデータについてさらなる解析を行う。 -
細胞内シグナルによる神経活動と情動行動・学習の制御機構の解明
研究課題/研究課題番号：17H01380 2017年4月 - 2021年3月
貝淵 弘三
担当区分：研究分担者
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：マウス線条体スライスへのアデノシンA2A受容体作用薬による刺激やマウス個体への選択的セロトニンの再取り込み阻害剤の連続投与によりリン酸化が変動するタンパク質とそのリン酸化部位を同定した。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用： MYPT1上のRho-Kinaseのドッキングモチーフ(DM)として推定された配列がRho-Kinaseによるリン酸化に寄与した。また、DM配列のペプチドがリン酸化抑制効果を示した。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：cre依存的にRho-Kinase-DNやPAK-AIDを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをAdora2a-creマウスの側坐核に注入し、ドーパミンD2受容体を発現する中型有棘神経細胞(D2R-MSN)においてRho-KinaseやPAKの機能を抑制したところ、嫌悪学習・記憶が障害された。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：D1Rシグナル伝達により制御されるKCNQ2チャネルのリン酸化修飾の役割をin vivoで明らかにするため、KCNQ2リン酸化部位(S404 & S448)を欠損させた遺伝子変異マウスを作製した。リン酸化部位欠損マウスの線条体スライスにおいてD1R作動薬によるKCNQ2のリン酸化が認められないことを確認した。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：線条体スライスにおいてNMDA受容体刺激がARHGEF2、ARHGAP21及びARHGAP39のリン酸化を亢進した。これらのリン酸化の亢進はCaMKⅡ阻害剤やNMDA受容体阻害剤の処置により抑制された。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析： D1R-MSN特異的にNPAS4を欠損あるいは機能抑制させたところ、報酬学習・記憶が障害された。
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：セロトニンやアデノシン受容体刺激によりリン酸化が変動するタンパク質とそのリン酸化部位を同定し、KANPHOSデータベースに内部データとして登録した。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：推定したMYPT1上のRho-KinaseのDM配列がRho-Kinaseによるリン酸化に影響すること、DM配列のペプチドがリン酸化抑制効果を示すことを見出した。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用： cre依存的にPKA やPKC、CaMKⅡ、Rho-Kinase、PAKの機能を抑制するAAVベクターの作製を完了した。作製したAAVを用いD2R-MSNにおいてRho-KinaseやPAKの機能を抑制したマウスを作製した結果、嫌悪学習・記憶が障害されることを見出した。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いてMAPKによるKCNQ2リン酸化部位を欠損させた遺伝子変異マウスを作製した。リン酸化部位の欠損をシーケンス解析で確認するとともに、リン酸化部位欠損マウスの線条体スライスにおいてD1R作動薬によるKCNQ2のリン酸化が認められないことを見出した。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：新たにリン酸化抗体を作製し、NMDA受容体刺激がCaMKⅡ依存的にARHGEF2、ARHGAP21及びARHGAP39のリン酸化を亢進することを見出した。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：MAPKが転写因子NPAS4をリン酸化することで、NPAS4とCBPとの結合が増加し転写活性が上昇すること、D1R-MSNにおいてNPAS4が報酬学習・記憶を制御することを明らかにした (Funahashi et al. Cell Rep. 2019)。
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：引き続き、神経伝達物質の受容体作動薬によってリン酸化が変動するタンパク質を同定し、パスウェイ解析により各受容体の刺激に応答するシグナル経路を特定する。
(2) リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：MYPT1のDM配列を基に、Rho-kinaseの機能抑制ペプチドや活性モニターツールの作製・評価を試みる。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：cre依存的にPKAやPKC、CaMKⅡの偽基質配列を発現するAAVベクターを神経細胞種特異的に発現させ、PKAやPKC、CaMKⅡの活性を抑制し、情動行動・学習への影響を評価する。また、LOV-Trap法を用い光刺激依存的にin vivoでPKAやPKC、CaMKⅡの活性を制御する分子ツールの開発を進める。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：KCNQ2チャネルのリン酸化修飾の役割をin vivoで明らかにするため、リン酸化部位欠損マウスを用いて神経膜興奮性やKCNQ感受性電流を電気生理学的に評価する。
(5) シナプス可塑性の制御機構の解析：Rho-KinaseやSHANK3のコンディショナルノックアウトマウスを用い、側坐核のD1R-MSNやD2R-MSN特異的にRho-KinaseやSHANK3を欠損させ、情動行動・学習への影響を評価する。SHANK3のリン酸化部位変異体を発現するAAVベクターを用い、樹状突起スパインの形態やPSD95などの足場タンパク質との相互作用、AMPA型受容体やNMDA型受容体の膜上への局在を解析する。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：MKL2-DNを発現するAAVを用い、D1R-MSN特異的にMKL2の機能を抑制したマウスを作製し、情動行動・学習への影響を評価する。 -
神経回路における細胞種特異的な細胞内シグナル解析
研究課題/研究課題番号：15K06772 2015年4月 - 2019年3月
黒田 啓介
担当区分：研究代表者
配分額：5200000円 （ 直接経費：4000000円 、 間接経費：1200000円 ）
脳側坐核のD1R-MSNにおいてドーパミンはD1受容体、Gαsを介してPKAを活性化する。一方、D2R-MSNにおいてドーパミン／D2受容体／Gαi経路はアデノシン／A2A受容体／Gαs経路と拮抗している。D2受容体はドーパミンによって常時活性化されており、ドーパミン分泌が低下すると抑制が解除され D2R-MSNにおけるPKAが活性化する。活性化したPKAはRap1の活性化因子GEFであるRasGRP2をリン酸化し活性化するとともに、Rap1の不活性化因子GAPであるRap1GAPをリン酸化し不活性化する。これによりRap1／MAPKシグナルが活性化し、神経細胞の興奮性が亢進する。
抗精神病薬や抗うつ薬がドーパミンやセロトニンなどのモノアミンの作用を制御していることはよく知られているが、脳内においてどのような分子メカニズムによってその作用を発揮しているかは驚くほどわかっていない。本研究により側坐核の中型有棘神経細胞においてドーパミン受容体の下流で低分子量G蛋白質Rap1が神経細胞の興奮性を制御することで、情動を生み出すスイッチとして働いていることが明らかになった。本研究のようなアプローチで細胞内シグナル伝達機構を解明することによって、新たな治療ターゲットの発見に繋がると考えられる。