所属
環境医学研究所 生体適応・防御研究部門 准教授
大学院担当
大学院医学系研究科
職名
准教授
連絡先
マスダ ユウジ
増田 雄司
MASUDA Yuji
学位 1
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博士（農学） （ 1995年3月 東京大学 ）
研究分野 1
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その他 / その他 / 生化学
経歴 7
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名古屋大学大学院医学研究科総合医学専攻・准教授 名古屋大学環境医学研究所・准教授
2013年5月 - 現在
国名：日本国
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名古屋大学環境医学研究所・准教授
2011年10月 - 2013年4月
国名：日本国
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広島大学原爆放射線医科学研究所・助教
2007年4月 - 2011年9月
国名：日本国
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広島大学原爆放射線医科学研究所・助手
2002年4月 - 2007年3月
国名：日本国
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広島大学原爆放射能医学研究所・助手
1998年7月 - 2002年3月
国名：日本国
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ハーバード大学公衆衛生大学院・博士研究員
1996年9月 - 1998年6月
国名：アメリカ合衆国
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奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科・教務職員
1995年4月 - 1996年8月
国名：日本国
学歴 2
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東京大学 農学生命科学研究科 応用生命工学
- 1995年3月
国名： 日本国
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埼玉大学 理学部 生化学科
1986年4月 - 1990年3月
国名： 日本国
所属学協会 5
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日本癌学会
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日本放射線影響学会
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日本分子生物学会
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日本遺伝学会
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環境変異原学会
受賞 4
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日本遺伝学会第８８回大会 ベストペーパー賞
2017年3月 日本遺伝学会
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日本遺伝学会第８３回大会 ベストペーパー賞
2012年3月 日本遺伝学会
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日本遺伝学会第８２回大会 ベストペーパー賞
2011年3月 日本遺伝学会
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日本遺伝学会奨励賞
2008年 日本遺伝学会
論文 44
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Novel mechanisms for the removal of strong replication-blocking HMCES- and thiazolidine-DNA adducts in humans.
Sugimoto Y, Masuda Y, Iwai S, Miyake Y, Kanao R, Masutani C
Nucleic acids research 51 巻 ( 10 ) 頁： 4959 - 4981 2023年6月
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Stepwise multipolyubiquitination of p53 by the E6AP-E6 ubiquitin ligase complex. 査読有り
Masuda Y, Saeki Y, Arai N, Kawai H, Kukimoto I, Tanaka K, Masutani C
The Journal of biological chemistry 294 巻 ( 41 ) 頁： 14860-14875 2019年10月
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Spatiotemporal regulation of PCNA ubiquitination in damage tolerance pathways 招待有り 査読有り
Masuda Yuji, Masutani Chikahide
CRITICAL REVIEWS IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY 54 巻 ( 5 ) 頁： 418 - 442 2019年9月
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Preferential digestion of PCNA-ubiquitin and p53-ubiquitin linkages by USP7 to remove polyubiquitin chains from substrates 査読有り
Masuda Yuji, Kanao Rie, Kawai Hidehiko, Kukimoto Iwao, Masutani Chikahide
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 294 巻 ( 11 ) 頁： 4177 - 4187 2019年3月
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Regulation of HLTF-mediated PCNA polyubiquitination by RFC and PCNA monoubiquitination levels determines choice of damage tolerance pathway 査読有り
Masuda Yuji, Mitsuyuki Satoshi, Kanao Rie, Hishiki Asami, Hashimoto Hiroshi, Masutani Chikahide
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 46 巻 ( 21 ) 頁： 11340 - 11356 2018年11月
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Overexpression of Rev1 promotes the development of carcinogen-induced intestinal adenomas via accumulation of point mutation and suppression of apoptosis proportionally to the Rev1 expression level. 査読有り
Sasatani M, Xi Y, Kajimura J, Kawamura T, Piao J, Masuda Y, Honda H, Kubo K, Mikamoto T, Watanabe H, Xu Y, Kawai H, Shimura T, Noda A, Hamasaki K, Kusunoki Y, Zaharieva EK, Kamiya K*
Carcinogenesis. 2017 May 1;38(5):570-578. doi: 10.1093/carcin/bgw208. 38 巻 ( 5 ) 頁： 570-578 2017年5月
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USP7 Is a Suppressor of PCNA Ubiquitination and Oxidative-Stress-Induced Mutagenesis in Human Cells. 査読有り
Kashiwaba S#, Kanao R#, Masuda Y#, Kusumoto-Matsuo R, Hanaoka F, Masutani C* (#: co-first author)
Cell Rep. 13 巻 ( 10 ) 頁： 2072-2080 2015年12月
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Short CCG repeat in huntingtin gene is an obstacle for replicative DNA polymerases, potentially hampering progression of replication fork 査読有り
Le Hang Phuong, Masuda Yuji, Tsurimoto Toshiki, Maki Satoko, Katayama Tsutomu, Furukohri Asako, Maki Hisaji
GENES TO CELLS 20 巻 ( 10 ) 頁： 817 - 833 2015年10月
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Different types of interaction between PCNA and PIP boxes contribute to distinct cellular functions of Y-family DNA polymerases 査読有り
Masuda Y#, Kanao R#, Kaji K, Ohmori H, Hanaoka F, Masutani C* (#: co-first author)
Nucleic Acids Res. 43 巻 ( 16 ) 頁： 7898-7910 2015年9月
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Repair synthesis step involving ERCC1-XPF participates in DNA repair of the Top1-DNA damage complex 査読有り
Takahata Chiaki, Masuda Yuji, Takedachi Arato, Tanaka Kiyoji, Iwai Shigenori, Kuraoka Isao
CARCINOGENESIS 36 巻 ( 8 ) 頁： 841 - 851 2015年8月
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Kanao Rie, Masuda Yuji, Deguchi Saori, Yumoto-Sugimoto Mayumi, Hanaoka Fumio, Masutani Chikahide
PLOS ONE 10 巻 ( 2 ) 頁： e0118775 2015年2月
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A Novel ATM/TP53/p21-Mediated Checkpoint Only Activated by Chronic γ-Irradiation. 査読有り
Cao L, Kawai H*, Sasatani M, Iizuka D, Masuda Y, Inaba T, Suzuki K, Ootsuyama A, Umata T, Kamiya K, Suzuki F.
PLoS One. 9:e104279. 2014. 9 巻 頁： e104279 2014年8月
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Guanine-5-carboxylcytosine base pairs mimic mismatches during DNA replication. 査読有り
Shibutani T, Ito S, Toda M, Kanao R, Collins LB, Shibata M, Urabe M, Koseki H, Masuda Y, Swenberg JA, Masutani C, Hanaoka F, Iwai S, Kuraoka I.*
Sci Rep. 4 巻 頁： 5220 2014年6月
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A novel interplay between the Fanconi anemia core complex and ATR-ATRIP kinase during DNA cross-link repair. 査読有り
41 巻 ( 14 ) 頁： 6930-6941 2013年5月
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Strand breakage of (6–4) photoproduct-containing DNA at neutral pH and its repair by the ERCC1–XPF protein complex. 査読有り
11 巻 ( 21 ) 頁： 3526-3534 2013年3月
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En bloc transfer of polyubiquitin chains to PCNA in vitro is mediated by two different human E2-E3 pairs. 査読有り
Masuda Y*, Suzuki M, Kawai H, Hishiki A, Hashimoto H, Masutani C, Hishida T, Suzuki F, Kamiya K*.
Nucleic Acids Res. 2012年8月
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In Vitro Studies of Exchanges between Replicative and Translesion DNA Polymerases in the Eukaryotic Post-replication Repair Pathway 招待有り 査読有り
Masuda Y*
Genes and Environment 34 巻 ( 2 ) 頁： 70-76 2012年5月
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Molecular nature of radiation injury and DNA repair disorders associated with radiosensitivity. 招待有り 査読有り
Masuda Y, Kamiya K*
International Journal of Hematology 95 巻 ( 3 ) 頁： 239-245 2012年3月
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Asymmetric nature of two subunits of RAD18, a RING-type ubiquitin ligase E3, in the human RAD6A-RAD18 ternary complex 査読有り
Masuda Y*, Suzuki M, Kawai H, Suzuki F, Kamiya K.
Nucleic Acids Research 40 巻 ( 3 ) 頁： 1065-1076 2012年2月
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The Rev1 translesion synthesis polymerase has multiple distinct DNA binding modes
de Groote Frederik H., Jansen Jacob G., Masuda Yuji, Shah Dipen M., Kamiya Kenji, de Wind Niels, Siegal Gregg
DNA REPAIR 10 巻 ( 9 ) 頁： 915 - 925 2011年9月
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Regulation of DNA Polymerase POLD4 Influences Genomic Instability in Lung Cancer
Huang Qin Miao, Tomida Shuta, Masuda Yuji, Arima Chinatsu, Cao Ke, Kasahara Taka-Aki, Osada Hirotaka, Yatabe Yasushi, Akashi Tomohiro, Kamiya Kenji, Takahashi Takashi, Suzuki Motoshi
CANCER RESEARCH 70 巻 ( 21 ) 頁： 8407 - 8416 2010年11月
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DNA Replication-Coupled PCNA Mono-Ubiquitination and Polymerase Switching in a Human In Vitro System
Masuda Yuji, Piao Jinlian, Kamiya Kenji
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY 396 巻 ( 3 ) 頁： 487 - 500 2010年2月
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Specific amino acid residues are involved in substrate discrimination and template binding of human REV1 protein
Piao Jinlian, Masuda Yuji, Kamiya Kenji
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 392 巻 ( 2 ) 頁： 140 - 144 2010年2月
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Roles of POLD4, smallest subunit of DNA polymerase delta, in nuclear structures and genomic stability of human cells
Huang Qin Miao, Akashi Tomohiro, Masuda Yuji, Kamiya Kenji, Takahashi Takashi, Suzuki Motoshi
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 391 巻 ( 1 ) 頁： 542 - 546 2010年1月
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Translesional DNA Synthesis through a C8-Guanyl Adduct of 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) in Vitro REV1 INSERTS dC OPPOSITE THE LESION, AND DNA POLYMERASE kappa POTENTIALLY CATALYZES EXTENSION REACTION FROM THE 3 '-dC TERMINUS
Fukuda Hirokazu, Takamura-Enya Takeji, Masuda Yuji, Nohmi Takehiko, Seki Chiho, Kamiya Kenji, Sugimura Takashi, Masutani Chikahide, Hanaoka Fumio, Nakagama Hitoshi
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284 巻 ( 38 ) 頁： 25585 - 25592 2009年9月
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Biochemical analysis of human PIF1 helicase and functions of its N-terminal domain
Gu Yongqing, Masuda Yuji, Kamiya Kenji
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 36 巻 ( 19 ) 頁： 6295 - 6308 2008年11月
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[Induced mutagenesis and translesion DNA synthesis--structure and function of REV1].
Masuda Y, Kamiya K
Seikagaku. The Journal of Japanese Biochemical Society 80 巻 ( 9 ) 頁： 843 - 6 2008年9月
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DNA damage-induced ubiquitylation of RFC2 subunit of replication factor C complex.
Tomida J, Masuda Y, Hiroaki H, Ishikawa T, Song I, Tsurimoto T, Tateishi S, Shiomi T, Kamei Y, Kim J, Kamiya K, Vaziri C, Ohmori H, Todo T
The Journal of biological chemistry 283 巻 ( 14 ) 頁： 9071 - 9 2008年4月
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Structural studies of human PCNA mutant, REV6-1
Hishiki Asami, Hashimoto Hiroshi, Masuda Yuji, Saijo Shinya, Serizawa Aya, Kamiya Kenji, Ohmori Haruo, Shimizu Toshiyuki, Sato Mamoru
ACTA CRYSTALLOGRAPHICA A-FOUNDATION AND ADVANCES 64 巻 頁： C378 - C378 2008年
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Dynamics of human replication factors in the elongation phase of DNA replication
Masuda Yuji, Suzuki Miki, Piao Jinlian, Gu Yongqing, Tsurimoto Toshiki, Kamiya Kenji
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 35 巻 ( 20 ) 頁： 6904 - 6916 2007年11月
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Role of single-stranded DNA in targeting REV1 to primer termini
Masuda Yuji, Kamiya Kenji
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 281 巻 ( 34 ) 頁： 24314 - 24321 2006年8月
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The first US-Japan meeting on error-prone DNA synthesis, Maui, Hawaii, December 20-21, 2004.
Kamath-Loeb AS, Loeb LA, Masuda Y, Hanaoka F
DNA repair 4 巻 ( 6 ) 頁： 740 - 7 2005年6月
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Mouse Rev1 protein interacts with multiple DNA polymerases involved in translesion DNA synthesis.
Guo C, Fischhaber PL, Luk-Paszyc MJ, Masuda Y, Zhou J, Kamiya K, Kisker C, Friedberg EC
The EMBO journal 22 巻 ( 24 ) 頁： 6621 - 30 2003年12月
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Structure and enzymatic properties of a stable complex of the human REV1 and REV7 proteins
Masuda Y, Ohmae M, Masuda K, Kamiya K
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 278 巻 ( 14 ) 頁： 12356 - 12360 2003年4月
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Biochemical properties of the human REV1 protein.
Masuda Y, Kamiya K
FEBS letters 520 巻 ( 1-3 ) 頁： 88 - 92 2002年6月
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Hyper-processive and slower DNA chain elongation catalysed by DNA polymerase III holoenzyme purified from the dnaE173 mutator mutant of Escherichia coli.
Sugaya Y, Ihara K, Masuda Y, Ohtsubo E, Maki H
Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 7 巻 ( 4 ) 頁： 385 - 99 2002年4月
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Mechanisms of dCMP transferase reactions catalyzed by mouse Rev1 protein
Masuda Y, Takahashi M, Fukuda S, Sumii M, Kamiya K
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 277 巻 ( 4 ) 頁： 3040 - 3046 2002年1月
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Deoxycytidyl transferase activity of the human REV1 protein is closely associated with the conserved polymerase domain
Masuda Y, Takahashi M, Tsunekuni N, Minami T, Sumii M, Miyagawa K, Kamiya K
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 276 巻 ( 18 ) 頁： 15051 - 15058 2001年5月
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Murine and human SDF2L1 is an endoplasmic reticulum stress-inducible gene and encodes a new member of the Pmt/rt protein family
Fukuda S, Sumii M, Masuda Y, Takahashi M, Koike N, Teishima J, Yasumoto H, Itamoto T, Asahara T, Dohi K, Kamiya K
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 280 巻 ( 1 ) 頁： 407 - 414 2001年1月
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Single-turnover analysis of mutant human apurinic/apyrimidinic endonuclease
Lucas JA, Masuda Y, Bennett RAO, Strauss NS, Strauss PR
BIOCHEMISTRY 38 巻 ( 16 ) 頁： 4958 - 4964 1999年4月
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Roles of AP endonucleases in repair and genetic stability
Demple B, Bailey E, Bennett RAO, Masuda Y, Wong D, Xu YJ
ADVANCES IN DNA DAMAGE AND REPAIR 302 巻 頁： 59 - 66 1999年
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Rapid dissociation of human apurinic endonuclease (Ape1) from incised DNA induced by magnesium
Masuda Y, Bennett RAO, Demple B
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 273 巻 ( 46 ) 頁： 30360 - 30365 1998年11月
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Dynamics of the interaction of human apurinic endonuclease (Ape1) with its substrate and product
Masuda Y, Bennett RAO, Demple B
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 273 巻 ( 46 ) 頁： 30352 - 30359 1998年11月
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Isolation of temperature-sensitive aminoacyl-tRNA synthetase mutants from an Escherichia coli strain harboring the pemK plasmid.
Masuda Y, Tsuchimoto S, Nishimura A, Ohtsubo E
Molecular & general genetics : MGG 238 巻 ( 1-2 ) 頁： 169 - 76 1993年4月
共同研究・競争的資金等の研究課題 2
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チェックポイント機能を欠如したがん細胞特異的に化学療法の効果を増感させる薬剤の開発
2011年12月 - 2012年7月
研究成果最適展開支援プログラムA-STEPフィージビリティスタディステージ 探索タイプ
資金種別：競争的資金
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哺乳類での突然変異誘発の分子機構の解明
2003年4月 - 2007年3月
特色ある大学教育支援プログラム
資金種別：競争的資金
科研費 21
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脱塩基部位-タンパク質クロスリンクにより開始する新規DNA損傷トレランス経路
研究課題/研究課題番号：23K11418 2023年4月 - 2026年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
増田 雄司
担当区分：研究代表者
配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）
DNA損傷はがん化や老化プロセスを促進する主要な原因の一つであり、内因性/外因性のDNA損傷に対する細胞応答機構の重要性が指摘されている。脱塩基損傷は主要な内因性のDNA損傷であり、動物組織の細胞では非常に多くの脱塩基損傷が定常的に存在している。脱塩基損傷は内/外因性の酸化反応に起因するだけではなく、生命現象さまざまな局面(APOBECによる副反応、免疫細胞での体細胞超突然変異、受精卵の初期化過程)で生じ、ある局面では突然変異を誘発する一方、別の局面では突然変異を抑制する未解明の制御機構の存在が示唆される。本研究では脱塩基損傷から細胞を保護するために必要な未解明の制御メカニズムを明らかにする。
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誘発変異頻度を規定する損傷トレランス経路の時空間的制御の分子基盤の確立
研究課題/研究課題番号：18H03371 2018年4月 - 2022年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
増田雄司
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ユビキチン化PCNAの新規脱ユビキチン酵素による複合的損傷トレランス経路選択機構
研究課題/研究課題番号：16K12594 2016年4月 - 2018年3月
増田 雄司
担当区分：研究代表者
配分額：3770000円 （ 直接経費：2900000円 、 間接経費：870000円 ）
複製後修復機構として知られる損傷トレランス機構は、PCNAのユビキチン化によって制御される。モノユビキチン化PCNAは忠実度が低い損傷乗り越えDNA合成を、ポリユビキチン化PCNAは忠実度が高いtemplate switch経路を促進することから、その経路選択は遺伝的安定性の維持にとって極めて重要である。ところがヒト細胞ではポリユビキチン化PCNAがほとんど検出されず、その制御機構は不明な点が多い。本研究では、ユビキチン化PCNAの新規脱ユビキチン酵素を同定することによって、ヒトでの損傷トレランス制御機構を解析した。
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誘発突然変異頻度を適切に制御する損傷トレランス経路の生化学的分子基盤の確立
研究課題/研究課題番号：15H02818 2015年4月 - 2019年3月
増田 雄司
担当区分：研究代表者
配分額：12610000円 （ 直接経費：9700000円 、 間接経費：2910000円 ）
変異誘発は放射線や環境変異原によって引き起こされる重要な生物影響の一つであるが、その分子機構は不明な点が多く当該研究分野の重要課題である。誘発変異の主要な原因であるDNA損傷トレランスの二つの経路は、DNA複製の補助因子であるPCNAのユビキチン化によって制御され、複製の忠実度の低い損傷乗り越えDNA合成は点変異の誘発に関与し、鋳型鎖交換反応を介した経路は遺伝子重複等に関与することが指摘されている。従って、複製後修復経路の制御は遺伝的安定性の維持に極めて重要である。本研究では、ユビキチン化PCNAを標的とする様々な因子の機能解析を通して、 突然変異を制御する分子機能の解析を行った。
DNA損傷トレランスは紫外線などによるDNA損傷から生体を防御する分子機構であるが、一方で、変異誘発の原因となることから、その生物影響は所謂「諸刃の剣」である。またがん治療においては、ある種の抗がん剤への耐性や抗がん剤による変異誘発などに関与する。DNA損傷トレランスには二つの分子機構が知られており、その二つの分子機構の選択は、紫外線やDNA損傷を誘発する抗がん剤に暴露した細胞の生死や遺伝子変異の誘発リスクを適切に制御する上でとても重要である。本研究成果は、変異誘発についての科学的知見を新たにするだけでなく、紫外線や抗がん剤などによる生体応答を理解する上での知的基盤を与えるものである。 -
誘発突然変異頻度を適切に制御する損傷トレランス経路の生化学的分子基盤の確立
2015年4月 - 2018年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者
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PCNAの新規脱ユビキチン酵素群の同定と複製後修復経路の多重制御メカニズム
2014年4月 - 2016年3月
科学研究費補助金
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研究課題/研究課題番号：25241011 2013年4月 - 2016年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(A)
益谷 央豪, 増田 雄司, 金尾 梨絵
担当区分：連携研究者
ヒト細胞内で、PCNA3量体中の複数の分子のK164が同時にマルチ修飾を受けることにより、Polhによる損傷乗り越え複製とは異なる未知の複製阻害回避機構が活性化制御される。また、Polhは3つのPCNA相互作用領域とユビキチン結合領域を持ち、それぞれに固有かつ重複的な複雑な相互作用により制御されている。PCNAの可逆的なモノユビキチン化の制御には、複数の脱ユビキチン化酵素が寄与しており、USP1がDNA複製と協調して紫外線損傷の正確な乗り越え複製に寄与するのに対して、USP7は酸化的DNA損傷の修復に伴う突然変異を抑制している。DNA損傷による複製阻害の回避機構の包括的理解に繋がる成果を得た。
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誘発突然変異と複製後修復経路の制御機構の解明に向けた生化学的分子基盤の確立
2012年4月 - 2015年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者
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低線量放射線被ばくのゲノム損傷を測る分子的生物線量計の開発と発がんリスク評価
研究課題/研究課題番号：22310037 2010年 - 2012年
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
神谷 研二, 笹谷 めぐみ(豊島めぐみ), 飯塚 大輔, 増田 雄司
担当区分：研究分担者
最新の突然変異誘発機構の研究成果を応用して、低線量放射線被ばくに対する分子レベルの生物線量計の開発を試みた。生物線量計として、突然変異を誘発する Rev1 トランスジェニックマウスとヒト家族性大腸腺腫症のモデルマウスを交配した F1 マウスを使用した。その結果、F1 マウスは、自然誘発がんのみならず、放射線誘発がんを高頻度に発症した。このマウスを使うことで放射線発がんリスクを評価できる可能性があると考える。
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突然変異誘発に関与する複製後修復経路の分子機構の解明に向けた生化学的基盤の確立
2008年4月 - 2012年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者
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低線量放射線の被ばく線量を測る分子バイオドシメトリー法の開発と発がんリスク評価
研究課題/研究課題番号：17310036 2005年 - 2007年
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
神谷 研二, 増田 雄司, 豊島 めぐみ, 神谷 研二
担当区分：研究分担者
低線量放射線被ばくの健康影響を解明するためには高感度のバイオドシメトリーと発がん機構の解明に基づく発がんリスク評価が必要である。そのため,バイオドシメトリーを可能にする放射線高感受性マウスの開発とゲノム障害応答・修復蛋白質の機能解析とそれを利用した分子バイオドシメトリー法の開発を試みた。
1.放射線に高感度なモニターマウスの開発と特性解析
放射線に高感度なマウスを開発する為に,誤りがちな修復をする損傷乗り越えDNA合成遺伝子mRevlを過剰発現したトランスジェニックマウス(Revlマウス)を共同研究で作製した。このマウスは,発がん処理に対し発がん高感受性であることが明らかとなったので,このマウスの生物学的特性を解析した。さらに,REV1の過剰発現が細胞の特性に及ぼす影響を解析する目的で,テトラサンクリンでREV1の発現が誘導可能なヒト肉腫細胞を樹立した。この細胞の放射線感受性を検討した結果,この細胞は放射線照射後の生存率が対照群より上昇傾向にあることが明らかとなった。この様にREV1の過剰発現細胞は,放射線に抵抗性であることから,細胞が生き延びることで突然変異を蓄積しやすい特性を有することが示唆された。
2.低線量放射線を測定する分子バイオドシメトリー法の開発に関する研究
ゲノム損傷部位には、損傷応答に関連するタンパク質複合体が形成され、この複合体は免疫染色でドットとして可視化でき、その個数からゲノム損傷を定量できる。このような現象を利用した全く新しい分子バイオドシメトリー法を開発する一助としてゲノム損傷修復やDNA合成に関係するタンパク質の同定とその機能解析を進めた。そめ結果、幾つかのタンパク質因子の候補を同定した。それらのタンパク質因子について、分子バイオドシメトリー法に利用できるか否かの検討を行った。一方、ゲノム損傷に依存的なH2AXの修飾がクロマチンダイナミズムを増加させることを見出した。さらに、再構成系を用いて損傷乗り越えDNA合成機構の解析に成した。 -
複製エラーを起こす損傷乗り越え型DNA合成酵素Revlの機能解析と発がん
研究課題/研究課題番号：17013061 2005年
科学研究費助成事業 特定領域研究
神谷 研二, 増田 雄司
担当区分：研究分担者
高発癌性の色素性乾皮症バリアントの原因蛋白質が,損傷乗り越え型DNAポリメラーゼYファミリーに属するPolηであることから,損傷乗り越えDNA合成酵素の機能と発癌との関連が注目されている。Yファミリーに属するREV1は,error-proneのDNA修復に関与し,突然変異の誘発に重要な役割を担っている。我々は,損傷乗り越えDNA合成酵素REV1の機能と発癌との関連を調べるために以下の解析を行った。
(1)Rev1トランスジェニックマウス(Rev1マウス)の作成と発癌感受性の検討
変異原に高感度なマウスを開発する為に,Rev1を過剰発現したRev1マウスを作成した。プロモーターには,遺伝子発現の制御が可能なメタロチオネインプロモーターを用いた。各臓器でユビキタスなRev1発現を認めたマウスを用いて表現型解析を行った。T細胞を用いた放射線誘発のTCR突然変異頻度は,対照群に比べ高い傾向を認めた。化学発癌剤MNUによるリンパ腫の誘発では,対照群に比べ有意にリンパ腫発生頻度が上昇し,変異原に対し発がん高感受性マウスであることが確認された。
(2)REV1の機能解析とin vitro再構成系の確立
REV1は損傷部位に対してCを取り込む酵素であるが,加えて損傷乗り越えDNA合成経路全体を調節する第二の機能をもつことが示唆されている。生化学的解析により,REV1がssDNA結合活性をもち,ssDNAに結合したREV1はそのssDNA上をスライディングして,損傷部位にターゲティングされることを明らかにした。この性質はREV1に特異的であり,REV1の最初のターゲットがssDNAである可能性を示唆すると同時に,損傷乗り越えDNA合成経路全体を調節するREV1の第二の機能に関与する可能性がある。一方,in vitro再構成系を確立するためPolδ,PCNA,FFC,及びRPAの全ての構成蛋白を精製した。この蛋白質群をin vitroで再構成し,この系によりDNAが7kb以上合成されることを確認した。 -
ヒストンH2AX複合体のプロテオミクス解析による放射線ゲノム損傷の修復機構の解明
研究課題/研究課題番号：15651020 2003年 - 2005年
科学研究費助成事業 萌芽研究
神谷 研二, 増田 雄司, 井倉 毅
担当区分：研究分担者
放射線によるゲノム障害に対する損傷応答や修復機構には,機能的蛋白質複合体が大きく関与している。その中でヒストンH2AXは,重要な役割をなすと推定されているが,それを解析するには,H2AXの機能的蛋白質複合体の網羅的解析が必要である。本研究では,ハーバード大学中谷が開発した機能的蛋白質複合体の精製法を応用し,tagを付与したH2AX蛋白質複合体を培養細胞,及びトランスジェニックマウスを用いて,生理的条件下でのH2AX機能的蛋白質複合体の精製法を開発し,その網羅的MS/MS解析を行った。今年度は,培養細胞からのH2AX複合体の精製とその機能解析について報告する。
HeLa培養細胞にクローニングしたマウスH2AXをレトロウイルスを用いて導入し,安定形質株を樹立した。この細胞株より核分画を調整し,核抽出分画およびクロマチン分画においてH2AX複合体を精製した。H2AXを標識することにより2重鎖切断後のH2AX複合体の動態を解析した。その結果,H2AX複合体はゲノム損傷部位で高度に動的な状態にあることが判明した。このH2AXの動態は,損傷後のリン酸化とは関係なくモノユビキチン化に依存しており,このユビキチン化は,TIP60ヒストン・アセチラーゼによるアセチル化により制御されていた。一方,MS解析の結果,ヒストンH2AXは損傷依存的にTIP60ヒストンアセチル化酵素に結合し,損傷に伴いアセチル化されることが判明した。このアセチル化は,TIP60ノックダウン細胞では抑制されることからTIP60ヒストンアセチル化酵素が損傷依存的にヒストンH2AXのアセチル化を制御していることが示された。この様にH2AX複合体の動態は,ゲノム損傷後のH2AXのアセチル化とモノユビキチン化により制御されており,今まで不明であったゲノム損傷初期のクロマチン・ダイナミズムと細胞応答に重要な役割をなすものであることが推定された。 -
DNA損傷修復におけるhEPC1ポリコーム蛋白質複合体のプロテオミクス解析
研究課題/研究課題番号：15370078 2003年 - 2004年
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
井倉 毅, 神谷 研二, 増田 雄司
担当区分：研究分担者
クロマチン構造変換機構の一つとしてヒストンのアセチル化があるが、これまでヒストンのアセチル化がどうのようにクロマチン損傷修復に関与しているかは明らかにされていない。申請者はこれまでヒストンアセチル化酵素TIP60複合体がDNA損傷修復に関与することを示してきた。さらにTIP60複合体が損傷に伴い、複合体構成因子の再編成がおこることを明らかにした。再編成された結果、DNA損傷後のTIP60複合体はリン酸化されたヒストンH2AXを含むこと、さらに複合体の構成因子の一つであるEnhancer of polycomb (hEPC1)がDNA損傷後の複合体再編成の過程でTIP60複合体とは異なる、新たな複合体を形成することを明らかにした。本申請課題では、Enhancer of polycomb (hEPC1)のDNA損傷修復における役割を明らかにし、ピストンのアセチル化のDNA損傷修復における役割を分子レベルで解明することを目的とする。
1)精製したhEPC1 (Enhancer of polycomb)複合体のマススペクトロメトリー(MS)解析
ヒストンH2AX、リン酸化酵素、ヒストンメチル化酵素およびTIP60をDNA損傷下で精製したhEPC1複合体に含まれるコンポーネントとして同定することに成功した。
2)hEPC1のDNA修復への関与を明らかにするためのhEPC1 siRNA発現knock down細胞を用いたin vivo検定。
レトロウイルスのsiRNAのシステムを用いてhEPC1がknock downされたHeLa細胞株を作成、ガンマ線照射後のヒストンH2AXのリン酸化への影響を検討し、また放射線感受性についてはコロニー形成能をみることにより解析した。結果、hEPC1のknock down細胞では損傷後にみられるH2AXのリン酸化が抑制されることが明らかになった。また放射線感受性においてもコントロールHeLa細胞株に対し、hEPC1 knock down HeLa細胞株はコロニー形成能が抑制された。
3)hEPC1複合体特異的な酵素活性の検討。
MS解析のデータに基づき、in vitroでヒストンアセチル化酵素活性、ヒストンメチル化酵素活性を確認した。リン酸化酵素活性については、hEPC1のknock down細胞ではH2AXのリン酸化が抑制されるという事実からhEPC1複合体中にリン酸化酵素が存在することが示唆された。 -
損傷乗り越え複製においてDNA複製エラーを起こすRev1の機能解析と発がん
研究課題/研究課題番号：15023240 2003年
科学研究費助成事業 特定領域研究
神谷 研二, 増田 雄司
担当区分：研究分担者
ヒトREV1は,損傷乗り越え型DNAポリメラーゼYファミリーの一つで,鋳型塩基に対してdCMPを取り込むdCMP transferase活性を持つ。Yファミリーに属するXPVが色素性乾皮症の原因遺伝子として同定されたことから,損傷乗り越えDNA合成の機能変化と発癌との関連が注目されている。REV1遺伝子は,error-proneのDNA修復に関与し,突然変異の誘発に重要な役割を担っている。我々は,損傷乗り越えDNA合成に関与するREV1遺伝子の機能と発癌との関連を調べるために,REV1の生化学的解析を行った。その結果,ヒトREV1タンパク質のdCMP転移活性は,鋳型Gと脱塩基部位に対して効率が高いことから,REV1が脱塩基部位の損傷乗り越えDNA合成に重要な役割を担い,点突然変異を誘発する可能性が高いことが示唆された。この事から,REV1の機能亢進は,点突然変異を生成し易い遺伝的不安性を誘導し,発がんに関与する可能性が考えられた。一方,Rev1が相互作用する蛋白質を解析した結果,Rev7とPolκがRev1のC末端100アミノ酸残基に競合的に結合する事を生化学的に証明した。さらに,Polη,Polτも同じくRev1のC末端に結合することを見いだし,Rev1が他の損傷乗り越えDNAポリメラーゼと複合体を形成する一端を明らかにした。さらに,放射線や化学発がん剤に高感度なマウスを開発する為に,mRev1を過剰発現したトランスジェニック(Tg)マウスの作成を行った。遺伝子発現の制御が可能なメタロチオネインプロモーターの下流にmRev1遺伝子を組み込んだMT-1プラスミドを構築し,Tgマウスの作成を行った。その結果,現在までに7系の独立したRev1トランスジェニックマウスを得た。これらマウスの各臓器よりmRNAを取り出し,mRev1トランスジーンの発現をRT-PCR法で検討した。各臓器でmRev1トランスジーンが発現していることを確認した。
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低線量放射線の線量推定のための分子バイオドシメトリー法の開発と発がんリスク評価
研究課題/研究課題番号：14380252 2002年 - 2004年
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
神谷 研二, 増田 雄司, 井倉 毅
担当区分：研究分担者
放射線の被曝線量と発がんリスクを評価するために,放射線高感受性マウスの開発とゲノム障害・修復蛋白質を利用した分子バイオドシメトリーの開発を行った。
1.エイムス試験の原理による放射線に高感度なマウスモニター系の開発
放射線に高感度なマウスを開発する為に,誤りがちな修復をする損傷乗り越えDNA合成遺伝子mRev1を過剰発現したトランスジェニックマウス(Rev1マウス)を作成した。遺伝子発現の制御が可能なメタロチオネインプロモーターを用いて7系の独立したRev1トランスジェニックマウスを得た。これらマウスの各臓器よりmRNAを取り出し,mRev1トランスジーンの発現をRT-PCR法で確認した。その結果,各臓器でのユビキタスな発現を認めた。また,蛋白質の発現をWestern法,及び免疫組織化学で検討し,小腸での誘導可能な発現を認めた。一方,Rev1トランスジェニックマウスのT細胞を用いた放射線誘発のTCR突然変異頻度は,対照群に比べ高い傾向を認めた。
2.低線量放射線の分子バイオドシメトリー法の開発
分子バイオドシメトリー法の開発を目指し,二重鎖切断部位で定量的にドットとして蛍光染色出来る蛋白質としてヒストンH2AXに注目し,H2AX蛋白質複合体の精製と機能解析を行った。HeLa培養細胞にクローニングしたマウスH2AXをレトロウイルスを用いて導入し,安定形質株を樹立した。この細胞株より核分画を調整し,核抽出分画およびクロマチン分画においてH2AX複合体を精製した。H2AXを標識することにより2重鎖切断後のH2AX複合体の動態を解析した。その結果,H2AX複合体はゲノム損傷部位で高度に動的な状態にあることが判明した。このH2AXの動態は,損傷後のリン酸化とは関係なくモノユビキチン化に依存しており,このユビキチン化は,TIP60ヒストン・アセチラーゼによるアセチル化により制御されていた。このH2AX複合体の動態は,ゲノム損傷後の細胞応答での初期過程に重要であり,損傷部位での修復蛋白質等のリクルートやその安定化に重要な役割をなすと推定された。 -
損傷乗り越え複製においてDNA複製エラーを起こすRev1の機能解析と発がん
研究課題/研究課題番号：14026031 2002年
科学研究費助成事業 特定領域研究
神谷 研二, 増田 雄司
担当区分：研究分担者
ヒトREV1遺伝子は,損傷乗り越え型DNAポリメラーゼをコードするumuC/dinB/XPV遺伝子ファミリーのメンバーであり,鋳型塩基に対してdCMPを取り込むdCMP transferase活性を持つ。XPV遺伝子は色素性乾皮症の原因遺伝子として同定されたことから,損傷乗り越えDNA合成の機能変化と発癌との関連が示唆されている。また,REV1遺伝子は,error-proneのDNA修復に関与し,突然変異の誘発に重要な役割を担っている。我々は,損傷乗り越えDNA合成に関与するREV1遺伝子の機能と発癌との関連を調べるために,REV1の生化学的解析を行った。精製したREV1タンパク質のdNMP転移反応をプライマー伸長法により測定した結果,鋳型G及び脱塩基部位に対して同等に最も効率よくdCMPを挿入した。この結果は,REV1が脱塩基部位の損傷乗り越えDNA合成に重要な役割を担い,その部位にdCMPを挿入した場合は,点突然変異を誘発する可能性が高いことを示す。この事から,REV1の機能亢進は,点突然変異を生成し易い遺伝的不安性を誘導し,発がんに関与する可能性が示唆された。一方,REV1が相互作用する蛋白質を解析した結果,REV7がREV1のC末端に結合する事を生化学的に証明し,REV1が他の修復蛋白質と複合体を形成する一端を明らかにした。さらに,Rev1トランスジェニックマウスの作製を進め,36匹のマウスを得たので,今後トランスジーンの発現を確認する
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哺乳類の突然変異誘発に関与するDNA複製装置のin vitroでの再構成
研究課題/研究課題番号：13780559 2001年 - 2002年
科学研究費助成事業 若手研究(B)
増田 雄司
担当区分：研究代表者
配分額：2100000円 （ 直接経費：2100000円 ）
DNA損傷の多くは、正常な塩基対合を防げることによりDNA合成を阻害することが知られている。ところが最近、これらの損傷DNAを鋳型として、効率よくDNA合成を行う特殊なDNAポリメラーゼ(損傷乗り越え型DNAポリメラーゼ)が多数発見された。この損傷乗り越え型DNAポリメラーゼは原核生物から真核生物まで広く保存されており、DNA複製の停止を回避するために重要な機能を担っていることが明らかとなってきた。
本研究では、哺乳類の損傷乗り越えDNA合成の分子機構を明らかにするために、損傷乗り越え型DNAポリメラーゼの一つであるREV1遺伝子を同定し、その機能解析を行った。ヒトREV1遺伝子は1250アミノ酸残基からなるタンパク質を、マウスRev1遺伝子は1249アミノ酸残基からなるタンパク質をコードすることが分かった。REV1/Rev1タンパク質の生化学的解析を行うために、これらの遺伝子を大腸菌で過剰発現させた後、各種クロマトグラフィーによってREV/Rev1タンパク質を精製した。REV1/Rev1タンパク質の酵素活性をプライマー伸長反応により測定したところ、これらのたんぱく質は鋳型のグアニンに特異的にdCMPを重合するdCMP転移酵素であることを証明した。次に、REV1/Rev1タンパク質の損傷乗り越えDNA合成活性を、ウラシル残基と脱塩基部位を鋳型に持つモデル基質を用いて測定した。脱塩基部位は鋳型塩基が欠落した構造のために複製型DNAポリメラーゼによるDNA合成を強く阻害する。ところがREV1/Rev1タンパク質は脱塩基部位に対してグアニンと同程度の効率でdCMPを取り込むことが明らかとなった。Rev1タンパク質のこの酵素活性が、損傷を乗り越えてDNA合成を行うための重要な機能であると思われる。さらに、ヒトREV1タンパク質については、多数の欠失型タンパク質を作成し、dCMP転移活性と、DNA結合活性に必要な領域を同定した。
さらに本研究では、ヒトREV1タンパク質とヒトREV7たんぱく質が安定なヘテロ二量体を構成することを示した。この複合体の酵素活性はREV1単独のそれと同等であったことから、REV7タンパク質はREV1とそれ以外のタンパク質との相互作用を仲介し高次複合体を構成するために必要なサブユニットであると考えられた。 -
トリチウム水の被曝線量推定のための分子バイオドシメトリー法とモニターマウスの開発
研究課題/研究課題番号：12558049 2000年 - 2002年
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
神谷 研二, 隅井 雅晴, 増田 雄司, 小松 賢志, 井倉 毅
担当区分：研究分担者
トリチウム水の被曝線量を推定するために個体,及び分子レベルでのモニター系の開発を行なった。
1.Rev1遺伝子の機能を利用した放射線に高感度なマウスモニター系の開発
(1)Rev1/REV1の機能解析:マウス及びヒトのRev1の機能解析を行った。Rev1は,dCMP transferase活性を有し,脱塩基部位の損傷乗り越えDNA合成を行うことで点突然変異を誘発することを明らかにした。また,Rev1は,放射線照射で誘導された。この事から,REV1の機能亢進は,放射線被曝に高感度に反応して突然変異を生成する可能性の高いことが示唆された。
(2)Rev1トランスジェニックマウス(Tg)の作製:放射線に高感度なモニターマウスを作成する為,mRev1を組み込んだTgマウスを作成した。発現制御が可能なメタロチオネインプロモーターの下流にmRev1遺伝子を組み込んだMT-1プラスミドベクターを作成し,近交型マウスC57BL/6NJclに導入した。その結果,現在までに36匹のマウスを得た。今後,mRev1遺伝子発現を確認する予定である。
2.HTOβ線の分子バイオドシメトリー法の開発
(1)2重鎖切断部位に結合する蛋白質の同定と抗体の作成:DNA二重鎖切断によりヒストンH2AXが特異的にリン酸化される(γ-H2AX)。このリン酸化を特異的に認識する抗体を用いて蛍光抗体染色を行ない、DNA損傷時にH2AXのfociが形成されることを確認した。さらに、DNA損傷時にヒストンH2AXに結合するKU70/KU80,Tip60等の蛋白複合体をMS/MS解析し,新規H2AX結合因子群を同定した。さらに、これらに対する特異的抗体を作成し、蛍光抗体染色によりfoci形成の有無を検定した。また,NBS1が、γ-H2AXと共局在しfociを形成することを見出した。現在,2重鎖切断の数とfoci形成数の相関を検討中である。 -
研究課題/研究課題番号：11680549 1999年 - 2001年
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
神谷 研二, 井倉 毅, 隅井 雅晴, 増田 雄司
担当区分：研究分担者
放射線誘発がんの分子機構を解明しリスク評価に応用する目的で、B6C3F1マウス肝癌における遺伝子発現異常をdifferential display法により解析し、過剰発現している3個の新規遺伝子のクローニングに成功した。第一の遺伝子は、317個のアミノ酸をcodeしておりshort chain dehydrogenaseに属するcis-retinol/androgen dehydrogenase 1、及び2(CRAD1,2)と高い相同性を有することからCRAD3と名付けた。Androgenを基質とした酵素活性の測定を行った結果、3α-adiolをdihydrotestosteroneに酸化する反応のKmは0.04μMで、3つのCRAD遺伝子の中で最も高活性であった。実際の肝癌でのこの酵素活性も正常肝より高い活性を認めた。従って、肝癌では、CRAD3の発現増加によりdihydrotestosterone濃度が高く維持されており、これが肝癌発症を促進すると考えられる。第二の遺伝子は、221アミノ酸配列のORFを有し、stromal cell-derived factor 2(SDF2)と極めて類似した蛋白であったので、SDF2 like-1(Sdf211)と名付けた。Sdf211蛋白は、マンノース転移酵素活性ドメインをもつPmt/rtファミリーの中心部分と相同性を示した。Sdf211蛋白は、小胞体ストレス誘導蛋白に特徴的なKDEL配列に似たHDELを有した。そこで、小胞体ストレス誘発剤を用いて肝癌細胞株での小胞体ストレス応答を解析した。その結果、Sdf211は、小胞体ストレスで誘導された。第3の遺伝子は、他の遺伝子と相同性がなくA141-36遺伝子と名付けた。この遺伝子産物は、核に局在しマウス肝癌の9例中7例(78%)で発現が増加していた。また、軟寒天培地でコロニー形成能が高いマウス肝癌細胞株でこの遺伝子の発現が増加していた。従って、マウスA141-36の発現は、肝癌の発症と関係する可能性がある。一方、放射線発がんでは、自然突然変異がその発症に重要な役割をなすと考えられる。大腸菌での解析から、この突然変異の発生は、「誤りがちなDNA修復」に関与するumuC, umuD遺伝子などによって制御されている事が示されている。我々は、酵母で同様な機能を担うREV1遺伝子と相同性を有するヒトとマウスの遺伝子(hREV1,mRev1)のクローニングに成功した。放射線で誘発される突然変異と遺伝的不安定性の分子機構を解析する目的の一助としてこの遺伝子の機能解析を行った。その結果、ヒトとマウスのREV1タンパク質はDNAポリメラーゼの活性を持たず、dCMPをプライマーの3'端に特異的に挿入する活性を有した。REV1タンパク質のdCMP転移活性とDNA結合活性は、損傷乗り越え型のDNAポリメラーゼに保存された領域にあることが示された。さらに、マウスRev1遺伝子は、γ線照射により誘導されることが分かった。
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ヒトとマウス肝癌のLOH領域の相同性を利用した肝癌抑制遺伝子の単離に関する研究
研究課題/研究課題番号：10877039 1998年 - 2000年
科学研究費助成事業 萌芽的研究
隅井 雅晴, 増田 雄司, 神谷 研二
担当区分：研究分担者
B6C3F1マウスの肝癌より樹立した肝癌細胞株には,高頻度に4番染色体のLOHが存在した.LOHの最小欠失領域はD4Mit37領域の2cMの範囲で,この領域は肝細胞の不死化遺伝子座(Lci)を含んだ.このLOH領域は,ヒト染色体の1p32-36に相同し,ヒト肝癌でもこの領域にLOHが存在する事から,ここに肝癌抑制遺伝子が存在すると推定されている.そこで我々は,4番染色体にLOHを有する細胞株とそうでない細胞株を用いて,mRNAの発現レベルが変化している遺伝子の同定を行う目的でdifferential display法による解析を行った.その結果,LOHを有する細胞株においてmRNAの発現量が増加しているマウス新規遺伝子A141-36のクローニングに成功した.同時に,そのヒトの相同遺伝子であるヒトA141-36をクローニングした.マウスA141-36遺伝子は,マウス肝癌の9例中7例(78%)で発現が増加していた.また,マウスA141-36遺伝子の発現は,軟寒天培地でコロニー形成能を有するマウス肝癌細胞株で増加している傾向を認めた.一方,ヒトA141-36は,約2500bpの塩基配列からなり748個のアミノ酸をコードしていた.ヒトA141-36は,マウスA141-36とidentity34%,similarity44%であった.ヒトA141-36遺伝子の組織発現は,精巣で強く発現していたが,他の組織では殆ど発現を認めなかった.ヒトA141-36遺伝子の発現は,ヒト肝癌では全例(5例中5例)で増加していた.さらに,慢性骨髄性白血病細胞株K-562,大腸癌細胞株SW480,前立腺癌細胞株PC3,DU145などでも発現亢進を認めた.従って,ヒトA141-36の発現増加は,肝癌以外の悪性腫瘍においても発症と関係する可能性が考えられた.抗ペプチド抗体を用いた免疫染色により,ヒトA141-36は核に存在する蛋白であることが判明した.現在,更に機能解析を進めている.一方,LOHを有する細胞株で発現が低下している遺伝子としてInsulin-like growth factor binding protein-related protein-1(IGFBP-rP1/IGFBP-7)を同定した.この遺伝子は,原発性肝癌においても発現低下が認められた.
肝癌細胞株では足場非依存性増殖能の強い細胞株においてIGFBP一rP1の発現低下が著明であった.
IGFBP-rP1を強制発現した細胞株では,増殖速度,足場非依存性増殖能,in vivoでの腫瘍形成能の低下を認めた.またヒト肝癌もIGFBP-rP1の発現低下を認めた.これらの結果より,IGFBP-rP1の発現低下は肝癌の発生,増殖に関与していることが示唆された.