Country：United States

Country：Japan

Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) 

In human cells, multiple units of a PCNA homo-trimer are simultaneously mono-ubiquitinated at K164, which could activate unidentified mechanisms other than Polh-mediated translesion synthesis to replicate damaged DNA. Human Polh contains three PCNA-interacting motifs and a ubiquitin-interacting domain, all of which are included in the regulation of Polh-mediated translesion synthesis in a cooperative and redundant manner. A deubiquitinating enzyme, USP1, plays a crucial role in the regulation of DNA replication-coupled translesion DNA synthesis past UV-induced DNA lesions. USP7 is also involved in the PCNA deubiquitination and suppresses oxidative-stress-induced mutagenesis.

Authorship：Principal investigator 

Authorship：Coinvestigator(s) 

It was explored the development of a biological dosimeter for low dose irradiation using our latest research data about mutagenesis. Rev1 Tg mice and Apc^Min/+mice, which are the model mice for human familial adenomatous polyposis coli, are used to generate Apc^Min/+; Rev1 Tg mice. The incidence of spontaneous and radiation-induced intestinal adenoma in Apc^Min/+; Rev1 Tg mice was significantly higher than that in Apc^Min/+; mice. Apc^Min/+; Rev1 Tg mouse is thought to be useful for the study of risk estimation of radiation-induced cancers.

Authorship：Principal investigator 

Authorship：Coinvestigator(s) 

We have tried to develop the hypersensitive mouse model and molecular bio-dosimery using DNA damage response proteins based on these functional analyses for the estimation of carcinogenic risk and dose after radiation exposure.
1. Development of hypersensitive monitor mouse for the estimation of low-dose radiation exposure and analysis of its biological character
The Y-family DNA polymerases play roles for maintenance of genetic stability. Malfunction of the polymerases affect cancer susceptibility. Revl, the number of the Y-family DNA polymerase, has deoxycytidyl transferase activity and plays the central role on the translesion DNA synthesis known as error-prone DNA repair. In order to develop hypersensitive model mouse for radiation exposure, we have generated Levi transgenic mice (Rev1 mouse). Therefore Levi mouse showed increased susceptibility to tumorigenesis after carcinogenic insult, we analyzed the biological character of this mouse. Furthermore, to determine how increasing .REV1 affects the biological phenotype of cells, human fibrosarcoma cells were transfected with hREV1 expression plasmid having tetracycline regulation system and then the stable sublines were isolated. We found that the cells expressing hREV1 were resistant to the cytotoxic effect of X-ray irradiation more than parental cells. This observation suggests the survived cells may increase the accumulation of mutations after the repair process of damaged DNA.
2. Research on the development of molecular bio-dosimery for low dose radiation
In order to develop new molecular bio-dosimery, we have focused our research on functional analysis of protein complex on damaged site of genome including Histone H2AX and REV1 complex which are visualized as foci and countable in cell nucleus. We have detected the possible candidate molecules for the molecular bio-dosimery. We found DNA damage-dependent modification of H2AX enhances chromatin dynamics. We also succeeded in analysis of translesion DNA sythesis on the reconstituteion system.

Authorship：Coinvestigator(s) 

高発癌性の色素性乾皮症バリアントの原因蛋白質が,損傷乗り越え型DNAポリメラーゼYファミリーに属するPolηであることから,損傷乗り越えDNA合成酵素の機能と発癌との関連が注目されている。Yファミリーに属するREV1は,error-proneのDNA修復に関与し,突然変異の誘発に重要な役割を担っている。我々は,損傷乗り越えDNA合成酵素REV1の機能と発癌との関連を調べるために以下の解析を行った。
(1)Rev1トランスジェニックマウス(Rev1マウス)の作成と発癌感受性の検討
変異原に高感度なマウスを開発する為に,Rev1を過剰発現したRev1マウスを作成した。プロモーターには,遺伝子発現の制御が可能なメタロチオネインプロモーターを用いた。各臓器でユビキタスなRev1発現を認めたマウスを用いて表現型解析を行った。T細胞を用いた放射線誘発のTCR突然変異頻度は,対照群に比べ高い傾向を認めた。化学発癌剤MNUによるリンパ腫の誘発では,対照群に比べ有意にリンパ腫発生頻度が上昇し,変異原に対し発がん高感受性マウスであることが確認された。
(2)REV1の機能解析とin vitro再構成系の確立
REV1は損傷部位に対してCを取り込む酵素であるが,加えて損傷乗り越えDNA合成経路全体を調節する第二の機能をもつことが示唆されている。生化学的解析により,REV1がssDNA結合活性をもち,ssDNAに結合したREV1はそのssDNA上をスライディングして,損傷部位にターゲティングされることを明らかにした。この性質はREV1に特異的であり,REV1の最初のターゲットがssDNAである可能性を示唆すると同時に,損傷乗り越えDNA合成経路全体を調節するREV1の第二の機能に関与する可能性がある。一方,in vitro再構成系を確立するためPolδ,PCNA,FFC,及びRPAの全ての構成蛋白を精製した。この蛋白質群をin vitroで再構成し,この系によりDNAが7kb以上合成されることを確認した。

Authorship：Coinvestigator(s) 

放射線によるゲノム障害に対する損傷応答や修復機構には,機能的蛋白質複合体が大きく関与している。その中でヒストンH2AXは,重要な役割をなすと推定されているが,それを解析するには,H2AXの機能的蛋白質複合体の網羅的解析が必要である。本研究では,ハーバード大学中谷が開発した機能的蛋白質複合体の精製法を応用し,tagを付与したH2AX蛋白質複合体を培養細胞,及びトランスジェニックマウスを用いて,生理的条件下でのH2AX機能的蛋白質複合体の精製法を開発し,その網羅的MS/MS解析を行った。今年度は,培養細胞からのH2AX複合体の精製とその機能解析について報告する。
HeLa培養細胞にクローニングしたマウスH2AXをレトロウイルスを用いて導入し,安定形質株を樹立した。この細胞株より核分画を調整し,核抽出分画およびクロマチン分画においてH2AX複合体を精製した。H2AXを標識することにより2重鎖切断後のH2AX複合体の動態を解析した。その結果,H2AX複合体はゲノム損傷部位で高度に動的な状態にあることが判明した。このH2AXの動態は,損傷後のリン酸化とは関係なくモノユビキチン化に依存しており,このユビキチン化は,TIP60ヒストン・アセチラーゼによるアセチル化により制御されていた。一方,MS解析の結果,ヒストンH2AXは損傷依存的にTIP60ヒストンアセチル化酵素に結合し,損傷に伴いアセチル化されることが判明した。このアセチル化は,TIP60ノックダウン細胞では抑制されることからTIP60ヒストンアセチル化酵素が損傷依存的にヒストンH2AXのアセチル化を制御していることが示された。この様にH2AX複合体の動態は,ゲノム損傷後のH2AXのアセチル化とモノユビキチン化により制御されており,今まで不明であったゲノム損傷初期のクロマチン・ダイナミズムと細胞応答に重要な役割をなすものであることが推定された。

Authorship：Coinvestigator(s) 

Eukaryotic genome is the tightly packed into the chromatin, a hierarchically organized complex of DNA and histone and nonhistone proteins. This packing represents a common obstacle for most of the DNA functions. Recently, we revealed that TIP60 histone acetylase complex involved in DNA repair and apoptosis. However, it remains unknown how TIP60 complex involves in DNA repair. To better understand the mechanism of TIP60 complex in DNA repair, TIP60 complex purifies from chromatin soluble fraction after DNA damage. As a result, enhancer of polycomb (hEPC1), the component of TIP60 complex, dissociated with the TIP60 complex. In order to clarify the role of hEPC1 in DNA repair,
We purified the hEPC1 from HeLa after induction of DNA damage. hEPC1 was included in multiple protein complex. MS/MS analysis indicated that kinase, metyltransferase enzyme, histone H2AX, TIP60 histone acetylase and ubiquitin related proteins were identified as a component of hEPC1 complex. Metyltransferase activity was observed. In addition, Histone H2AX is phosphorylated after DNA damage. The phosphorylation of H2AX was inhibited in HeLa cells expressing siEPC RNA suggested that the hEPC1 complex includes kinase domain.

Authorship：Coinvestigator(s) 

ヒトREV1は,損傷乗り越え型DNAポリメラーゼYファミリーの一つで,鋳型塩基に対してdCMPを取り込むdCMP transferase活性を持つ。Yファミリーに属するXPVが色素性乾皮症の原因遺伝子として同定されたことから,損傷乗り越えDNA合成の機能変化と発癌との関連が注目されている。REV1遺伝子は,error-proneのDNA修復に関与し,突然変異の誘発に重要な役割を担っている。我々は,損傷乗り越えDNA合成に関与するREV1遺伝子の機能と発癌との関連を調べるために,REV1の生化学的解析を行った。その結果,ヒトREV1タンパク質のdCMP転移活性は,鋳型Gと脱塩基部位に対して効率が高いことから,REV1が脱塩基部位の損傷乗り越えDNA合成に重要な役割を担い,点突然変異を誘発する可能性が高いことが示唆された。この事から,REV1の機能亢進は,点突然変異を生成し易い遺伝的不安性を誘導し,発がんに関与する可能性が考えられた。一方,Rev1が相互作用する蛋白質を解析した結果,Rev7とPolκがRev1のC末端100アミノ酸残基に競合的に結合する事を生化学的に証明した。さらに,Polη,Polτも同じくRev1のC末端に結合することを見いだし,Rev1が他の損傷乗り越えDNAポリメラーゼと複合体を形成する一端を明らかにした。さらに,放射線や化学発がん剤に高感度なマウスを開発する為に,mRev1を過剰発現したトランスジェニック(Tg)マウスの作成を行った。遺伝子発現の制御が可能なメタロチオネインプロモーターの下流にmRev1遺伝子を組み込んだMT-1プラスミドを構築し,Tgマウスの作成を行った。その結果,現在までに7系の独立したRev1トランスジェニックマウスを得た。これらマウスの各臓器よりmRNAを取り出し,mRev1トランスジーンの発現をRT-PCR法で検討した。各臓器でmRev1トランスジーンが発現していることを確認した。

Authorship：Coinvestigator(s) 

We have tried to develop the hypersensitive mouse model and molecular bio-dosimery using DNA damage response proteins for the estimation of carcinogenic risk and dose after radiation exposure.
1.Development of hypersensitive mouse model for radiation exposure
Rev1 protein belongs to a family of translesion DNA polymerases. Rev1 is responsible for error-prone translesion synthesis and play a role in mutagenesis induced by DNA damage. REV1 is deoxycytidyltransferase that incorporates dCMP opposite template abasic sites.
In order to develop hypersensitive mouse model for radiation exposure, We have developed transgenic mouse (Tg) over expressing Rev1 gene under the constitutive zinc-induced transcriptional activation promoter. We've succeeded in establishing 7 Tg mouse line expressing Rev1 transgene. We examined sensitivity and mutation frequency of T-cell receptor (TCR) after radiation exposure, and found that Tg mouse was apt to have higher mutation frequency of TCR than normal mouse.
2.Development of molecular bio-dosimery for low dose radiation
In order to develop molecular bio-dosimery, We have focused our research on functional analysis of Histone H2AX complex which is phosphorylated after induction of DNA damage (γ-H2AX) and visualized as foci in cell nucleus. We found that H2AX became highly mobile after induction of DSBs. We further find that mobilization depends not on phosphorylation but rather on ubiquitination, and that ubiquitination of H2AX is, in turn, regulated by TIP60 histone acetylase which implicates TIP60 in DNA repair. These results suggest that mobilization of H2AX is an early and necessary step in repair of DNA DSB.

Authorship：Coinvestigator(s) 

ヒトREV1遺伝子は,損傷乗り越え型DNAポリメラーゼをコードするumuC/dinB/XPV遺伝子ファミリーのメンバーであり,鋳型塩基に対してdCMPを取り込むdCMP transferase活性を持つ。XPV遺伝子は色素性乾皮症の原因遺伝子として同定されたことから,損傷乗り越えDNA合成の機能変化と発癌との関連が示唆されている。また,REV1遺伝子は,error-proneのDNA修復に関与し,突然変異の誘発に重要な役割を担っている。我々は,損傷乗り越えDNA合成に関与するREV1遺伝子の機能と発癌との関連を調べるために,REV1の生化学的解析を行った。精製したREV1タンパク質のdNMP転移反応をプライマー伸長法により測定した結果,鋳型G及び脱塩基部位に対して同等に最も効率よくdCMPを挿入した。この結果は,REV1が脱塩基部位の損傷乗り越えDNA合成に重要な役割を担い,その部位にdCMPを挿入した場合は,点突然変異を誘発する可能性が高いことを示す。この事から,REV1の機能亢進は,点突然変異を生成し易い遺伝的不安性を誘導し,発がんに関与する可能性が示唆された。一方,REV1が相互作用する蛋白質を解析した結果,REV7がREV1のC末端に結合する事を生化学的に証明し,REV1が他の修復蛋白質と複合体を形成する一端を明らかにした。さらに,Rev1トランスジェニックマウスの作製を進め,36匹のマウスを得たので,今後トランスジーンの発現を確認する

Authorship：Principal investigator 

Grant amount：\2100000 （ Direct Cost: \2100000 ）

DNA損傷の多くは、正常な塩基対合を防げることによりDNA合成を阻害することが知られている。ところが最近、これらの損傷DNAを鋳型として、効率よくDNA合成を行う特殊なDNAポリメラーゼ(損傷乗り越え型DNAポリメラーゼ)が多数発見された。この損傷乗り越え型DNAポリメラーゼは原核生物から真核生物まで広く保存されており、DNA複製の停止を回避するために重要な機能を担っていることが明らかとなってきた。
本研究では、哺乳類の損傷乗り越えDNA合成の分子機構を明らかにするために、損傷乗り越え型DNAポリメラーゼの一つであるREV1遺伝子を同定し、その機能解析を行った。ヒトREV1遺伝子は1250アミノ酸残基からなるタンパク質を、マウスRev1遺伝子は1249アミノ酸残基からなるタンパク質をコードすることが分かった。REV1/Rev1タンパク質の生化学的解析を行うために、これらの遺伝子を大腸菌で過剰発現させた後、各種クロマトグラフィーによってREV/Rev1タンパク質を精製した。REV1/Rev1タンパク質の酵素活性をプライマー伸長反応により測定したところ、これらのたんぱく質は鋳型のグアニンに特異的にdCMPを重合するdCMP転移酵素であることを証明した。次に、REV1/Rev1タンパク質の損傷乗り越えDNA合成活性を、ウラシル残基と脱塩基部位を鋳型に持つモデル基質を用いて測定した。脱塩基部位は鋳型塩基が欠落した構造のために複製型DNAポリメラーゼによるDNA合成を強く阻害する。ところがREV1/Rev1タンパク質は脱塩基部位に対してグアニンと同程度の効率でdCMPを取り込むことが明らかとなった。Rev1タンパク質のこの酵素活性が、損傷を乗り越えてDNA合成を行うための重要な機能であると思われる。さらに、ヒトREV1タンパク質については、多数の欠失型タンパク質を作成し、dCMP転移活性と、DNA結合活性に必要な領域を同定した。
さらに本研究では、ヒトREV1タンパク質とヒトREV7たんぱく質が安定なヘテロ二量体を構成することを示した。この複合体の酵素活性はREV1単独のそれと同等であったことから、REV7タンパク質はREV1とそれ以外のタンパク質との相互作用を仲介し高次複合体を構成するために必要なサブユニットであると考えられた。

Authorship：Coinvestigator(s) 

We tried to develop bio-dosimetry system of tritium water at the level from whole body to molecule.
1) Development of Revl transgenic mice which are sensitive to radiation exposure
We characterized mouse and human Revl gene which was a member of the UmuC/DinB/XPV gene family, played important roles in spontaneous mutations. Biochemical analysis of the mouse Revl protein revealed that the mouse Revl protein possessed a deoxycytidyl transferase activity as human REV1 protein. The expression of mouse Revl in embryonic fibroblasts was induced by radiation exposure. Based on these knowledge, we try to establish Revl transgenic mouse to develop the hypersensitive mouse model to radiation exposure. We introduced MT-1 plasmid carrying mRevl down stream the metallotuionein promoter into C57BLmice. We already got 36 mice carrying mRevl. We will check the expression of mRevl.
2) Development of molecular bio-dosimetry system for tritium water
In repair machinery of DNA double trand break by radiation, Historic H2AX, Ku70, Ku80 and Tip60 are thought to play an important role. We observed that H2AX was phosphorylated (γ-H2AX) and formed foci after irradiation. In order to use the foci formation for the dosimetry of DNAdouble strand breaks, we purify the constitutive H2AX complex and identify its new components by MS/MS spectrometric analysis. We prepared antibody against these components and performed the immunohistochemical analysis to detect the foci at DNAdouble strand breaks. Furthermore, we found that NBS1 localized toγ-H2AX foci after radiation exposure. Relationship between numbers of foci and DNAdouble strand breaks is under investigation.

Authorship：Coinvestigator(s) 

To clarify the molecular mechanism of radiation-carcinogenesis, and apply it to the risk estimation, we conducted two experiments. Firstly, we analyzed the expression of genes in radiation-induced-mouse hepatomas. Mouse hepatomas were induced in B6C3F1 mice by 3Gy of ^<60>Coγ-ray exposure, and mRNAs were isolated from hepatomas and normal liver in the same mice. We identified differentially expressed genes by differential display technique. We found nineteen differentially expressed genes in hepatomas. Expressions of five genes were decreased and those of other fourteen genes were increase in hepatomas, including novel three genes named CRAD3 that was a member of cis-retinol/androgen dehydrogenase (CRAD) family, Sdf211 that was a member of Pmt/rt family, and A141-36 whose homology was not identified. CRAD plays an important role in androgen metabolism, which converts inactive 3α-adiol, into active dihydrotestosterone, (oxidative 3α-hydroxysteroid dehydrogenase activities : oxidative 3α-HSD activities) and consequently increases androgen activity. Actually, oxidative 3α-HSD activity in mouse hepatomas was found to be higher than that in normal liver at physiological 3α-adiol level. Dihydrotestosterone is well known to promote hepatocarcinogenesis. Therefore, the over-expression of CRAD3 must modify the radiation-induced mouse hepatocarcinogenesis by increasing local dihydrotestosterone level. Secondly, we try to clarify the involvement of spontaneous mutations in radiation carcinogenesis, because similarity of mutation spectra between radiation-induced and spontaneous cancers was well documented. We characterized mouse and human Revl gene which was a member of the UmuC/DinB/XPV gene family, played important roles in spontaneous mutations. Biochemical analysis of the mouse Rev1 protein revealed that the mouse Rev1 protein possessed a deoxycytidyl transferase activity as human REV1 protein. The expression of mouse Rev1 gene of primary embryonic fibroblasts in culture was induced by radiation exposure. This observation might be important, because the biochemical property suggested that the activity of the Rev1 protein was required for bypassing oxidative DNA damage by translesioh DNA synthesis during DNA replication.

Authorship：Coinvestigator(s) 

B6C3F1マウスの肝癌より樹立した肝癌細胞株には,高頻度に4番染色体のLOHが存在した.LOHの最小欠失領域はD4Mit37領域の2cMの範囲で,この領域は肝細胞の不死化遺伝子座(Lci)を含んだ.このLOH領域は,ヒト染色体の1p32-36に相同し,ヒト肝癌でもこの領域にLOHが存在する事から,ここに肝癌抑制遺伝子が存在すると推定されている.そこで我々は,4番染色体にLOHを有する細胞株とそうでない細胞株を用いて,mRNAの発現レベルが変化している遺伝子の同定を行う目的でdifferential display法による解析を行った.その結果,LOHを有する細胞株においてmRNAの発現量が増加しているマウス新規遺伝子A141-36のクローニングに成功した.同時に,そのヒトの相同遺伝子であるヒトA141-36をクローニングした.マウスA141-36遺伝子は,マウス肝癌の9例中7例(78%)で発現が増加していた.また,マウスA141-36遺伝子の発現は,軟寒天培地でコロニー形成能を有するマウス肝癌細胞株で増加している傾向を認めた.一方,ヒトA141-36は,約2500bpの塩基配列からなり748個のアミノ酸をコードしていた.ヒトA141-36は,マウスA141-36とidentity34%,similarity44%であった.ヒトA141-36遺伝子の組織発現は,精巣で強く発現していたが,他の組織では殆ど発現を認めなかった.ヒトA141-36遺伝子の発現は,ヒト肝癌では全例(5例中5例)で増加していた.さらに,慢性骨髄性白血病細胞株K-562,大腸癌細胞株SW480,前立腺癌細胞株PC3,DU145などでも発現亢進を認めた.従って,ヒトA141-36の発現増加は,肝癌以外の悪性腫瘍においても発症と関係する可能性が考えられた.抗ペプチド抗体を用いた免疫染色により,ヒトA141-36は核に存在する蛋白であることが判明した.現在,更に機能解析を進めている.一方,LOHを有する細胞株で発現が低下している遺伝子としてInsulin-like growth factor binding protein-related protein-1(IGFBP-rP1/IGFBP-7)を同定した.この遺伝子は,原発性肝癌においても発現低下が認められた.
肝癌細胞株では足場非依存性増殖能の強い細胞株においてIGFBP一rP1の発現低下が著明であった.
IGFBP-rP1を強制発現した細胞株では,増殖速度,足場非依存性増殖能,in vivoでの腫瘍形成能の低下を認めた.またヒト肝癌もIGFBP-rP1の発現低下を認めた.これらの結果より,IGFBP-rP1の発現低下は肝癌の発生,増殖に関与していることが示唆された.