国名：日本国

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国名： 日本国

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団体区分：学協会

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担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）

蛋白質が他の蛋白質や低分子リガンドと結合することによって複合体をつくるとき、構造変化を伴うことが多い。低分子リガンド結合を伴う折れ畳みでは、反応においてリガンド結合と折れ畳みのどちらが先に起こるのかに着目して研究がなされてきた。しかし、現実の系では、リガンド結合するにつれて折れ畳みが起こる、その逆など、互いに影響を及ぼし合いながら反応が進むことが予想される。反応を引き起こすしくみから考えはじめ、反応の物理的な機構を明らかにし、反応の様子を描く新たな方法を探索する。
本研究は、リガンド結合を伴うフォールディングについて、反応に関わる分子種や遷移状態の安定性と構造に基づいて、反応を駆動する物理的相互作用を明らかにすることを目的とする。目的の達成のため、モデル蛋白質スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)を用いて、SNaseの特異的リガンドである基質アナログadenosine-3',5'-diphosphate (prAp)によって引き起こされるフォールディングを実験とモデル解析によって調べる。令和2年度には、フォールディングの経路が、prAp濃度依存的にConformational selection (CS: 構造形成→リガンド結合)からInduced fit (IF: リガンド結合→構造形成)に切り替わることが明らかになり、反応の遷移状態がprApの二つのリン酸基に由来する静電相互作用によって安定化されることが示唆された。
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令和2年度に得られた成果に基づき、令和3年度には、prApの二つのリン酸基(5'-並びに3'-リン酸基)のそれぞれが、prApに引き起こされるフォールディングの各段階でどのような役割を果たすのかを原子団レベルの分解能で明らかにすることを目標とした。
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目標を達成するために、prApから一つリン酸基を欠損した「prAp変異体」adenosine-5'-monophosphate (prA: prApから3'-リン酸基を欠損)とadenosine-3'-monophosphate (rAp: prApから5'-リン酸基を欠損)について、prApと同様に穏和な変性条件下においてrAp, prAによって引き起こされるSNaseのフォールディングを調べた。IFが支配的な高リガンド濃度において、ほどけた状態は5'-リン酸基とより親和性が高いが、遷移状態は3'-リン酸基が安定化により寄与することが示唆された。
令和3年度に計画していた研究項目のうち、NMRを用いた実時間フォールディング測定およびその残基レベルの解析、変性状態のNMRスペクトルの帰属および変性状態におけるリガンド・蛋白質複合体の残基レベルの解析は終了した。令和4年度に計画していた研究項目のうち、prApからリン酸基を一つずつ除去したprAおよびrApを用いたフォールディングを調べた。
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prAおよびrApによるフォールディングを引き起こすための変性条件の最適化を行い、2.7 M尿素においてprAp, prA, rApおよびアデノシン（リン酸基を含まない「リン酸基二重変異体」）によるフォールディングを観測できることを確認した。prA, rAp存在下でのSNaseの1H-15N NMRスペクトルを天然状態、ほどけた状態について帰属した。蛍光およびNMRによってフォールディングの速度論を実時間で測定した。構造について、フォールディングの各段階におけるSNaseとそれぞれのリン酸基との親和性を残基レベルで明らかにした。安定性について、prApを「野生型」、prA / rApを「変異体」としたφ値解析により、遷移状態におけるそれぞれのリン酸基の安定性への寄与を評価した。
令和2年度に得られた成果に基づき、令和3年度においてはprApの各リン酸基のフォールディングにおける役割を原子団レベルで明らかにすることを優先課題とした。prApの「変異体」としてのprAおよびrApについて、リガンドによって引き起こされるSNaseのフォールディングの平衡論と速度論とを構造・安定性の双方の側面から明らかにした。令和4年度は、リガンド結合によるフォールディングの詳細をさらに調べることと研究全体の取りまとめを行う。

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：5330000円 （ 直接経費：4100000円 、 間接経費：1230000円 ）

本研究の目標は、蛋白質のフォールディングエネルギー地形を、実験の立場から定量的に記述し、蛋白質が天然状態へたどり着く機構を理解することである。スタフィロコッカル・ヌクレアーゼについて、蛍光共鳴エネルギー移動と超高速混合法とを組み合わせ、反応初期に非一様な構造形成が起こることを見いだした。これは初期中間体形成が特異的な相互作用に起因することを示唆する。アポミオグロビンについて、フォールディング反応初期に蓄積する中間体が平衡条件下において蓄積する中間体と同じ速度過程で形成することを見いだした。この結果は、これらの中間体が同一の分子種であることを示唆する。

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）

球状蛋白質スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ及びウマアポミオグロビンのフォールディングを速度論的手法と変異体解析を駆使して特徴付けた。スタフィロコッカル・ヌクレアーゼはフォールディング反応初期に特にβ-バレルドメイン内で顕著な凝縮が認められた。ウマアポミオグロビンは、反応開始後100マイクロ秒以内に中間体を蓄積し、更に逐次的に少なくとも二種類の中間体を経て天然状態に至ることが明らかになった。

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：3700000円 （ 直接経費：3700000円 ）

本研究計画の目的は、蛋白質のフォールディングの物理化学的機構を解明し、特にフォールディング中間体の役割を明らかにすることである。このために、蛋白質フォールディングの速度論的研究で現在広く用いられているストップト・フロー装置よりも不感時間が二桁以上短い超高速混合連続フロー装置を作成する。連続フロー法とストップト・フロー法とを組み合わせて用いることにより、フォールディング開始後数十マイクロ秒の反応初期から天然状態に至る構造形成過程を観測する。昨年度に引き続き、装置のさらなる不感時間の短縮を目指し、装置の不感時間は約100μsに向上した。また、1-アニリノナフタレン-8-スルホン酸の蛍光をプローブに用いることにより、トリプトファンの蛍光をプローブとする場合と比べて、遙かに低い蛋白質濃度(約5μM)で観測を行えることを確認した。
いくつかのモデル蛋白質について、マイクロ秒領域でのフォールディングを観測することができたものの、不感時間内に於けるシグナル変化(バースト相)が観測された。また、連続フロー法とストップト・フロー法とで観測可能な時間領域に2-3msのギャップがある。今後は、より曖昧さを排除した観測を行うために、1.より短い不感時間の連続フロー装置用溶液混合装置を作成すること、2.連続フロー法で観測できる時間領域を長くするための技術の開発、3.ストップト・フロー装置の不感時間を短縮する、の三点を解決することが必要である。