所属
トランスフォーマティブ生命分子研究所 特任講師
職名
特任講師
通称等の別名
佐藤 恵美
外部リンク
ミシロ エミ
三城 恵美
MISHIRO-SATO Emi
学位 1
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博士（農学） （ 2007年3月 鹿児島大学 ）
研究キーワード 1
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プロテオーム解析
研究分野 1
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ライフサイエンス / 応用生物化学 / 質量分析
経歴 3
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名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所 分子構造センターチーフ 特任講師
2022年2月 - 現在
国名：日本国
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愛知県がんセンター 研究所 がん病態生理学分野 非常勤職員
2021年4月 - 2022年1月
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愛知県がんセンター研究所 がん病態生理学分野 リサーチレジデント
2017年4月 - 2021年3月
所属学協会 4
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日本医用マススペクトル学会
2022年 - 現在
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日本質量分析学会
2021年 - 現在
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日本癌学会
2018年 - 現在
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日本プロテオーム学会
2008年 - 現在
委員歴 2
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日本プロテオーム学会 理事
2024年1月 - 現在
団体区分：学協会
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質量分析学会 中部談話会 世話人
2024年1月 - 現在
団体区分：学協会
論文 22
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LIPID RICH 1 Modulates Allocation of Carbon between Starch and Triacylglycerol in Arabidopsis Leaves.
Yamaguchi M, Shigenobu S, Yamaguchi K, Higashi Y, Okazaki Y, Saito K, Mishiro-Sato E, Kano K, Sugiyama R, Yamazaki M, Sugano SS, Fukuyoshi S, Ueda H, Hara-Nishimura I, Shimada TL
Journal of experimental botany 2025年2月
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Novel TORC1 inhibitor Ecl1 is regulated by phosphorylation in fission yeast. 国際誌
Ohtsuka H, Kawai S, Ito Y, Kato Y, Shimasaki T, Imada K, Otsubo Y, Yamashita A, Mishiro-Sato E, Kuwata K, Aiba H
Aging cell 頁： e14450 2025年2月
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A Protein Cleavage Platform Based on Selective Formylation at Cysteine Residues.
Zenmyo N, Matsumoto Y, Yasuda A, Uchinomiya S, Shindo N, Sasaki-Tabata K, Mishiro-Sato E, Tamura T, Hamachi I, Ojida A
Journal of the American Chemical Society 147 巻 ( 4 ) 頁： 3080 - 3091 2025年1月
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Identification of barley-derived peptides with angiotensin converting enzyme inhibitory activity
Endo K., Akiyama H., Kano K., Mishiro-Sato E., Karashima T., Kajiwara Y., Takashita H., Shimizu K., Honda H.
International Journal of Food Engineering 2025年
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TEAD-independent cell growth of Hippo-inactive mesothelioma cells: Unveiling resistance to TEAD inhibitor K-975 through MYC signaling activation. 国際誌
Akao K, Sato T, Mishiro-Sato E, Mukai S, Ghani FI, Kondo-Ida L, Imaizumi K, Sekido Y
Molecular cancer therapeutics 2024年12月
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Hasnat M.A., Ohmi Y., Yesmin F., Kaneko K., Kambe M., Kitaura Y., Ito T., Imao Y., Kano K., Mishiro-Sato E., Koyanagi H., Kawamoto Y., Bhuiyan R.H., Ohkawa Y., Tajima O., Furukawa K., Furukawa K.
International Journal of Molecular Sciences 25 巻 ( 23 ) 2024年11月
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Tahara K, Nakamura A, Wang X, Mitamura K, Ichihashi Y, Kano K, Mishiro-Sato E, Aoki K, Urano Y, Komatsu T, Tsukiji S
ACS chemical biology 19 巻 ( 12 ) 頁： 2438 - 2450 2024年11月
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Nambo M, Nishiwaki-Ohkawa T, Ito A, Ariki ZT, Ito Y, Kato Y, Yar M, Yim JC, Kim E, Sharkey E, Kano K, Mishiro-Sato E, Okimura K, Maruyama M, Ota W, Furukawa Y, Nakayama T, Kobayashi M, Horio F, Sato A, Crudden CM, Yoshimura T
Communications medicine 4 巻 ( 1 ) 頁： 152 2024年8月
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Sexually dimorphic auditory representation inAedes aegyptibrains
Takuro S. Ohashi, Yifeng Y.J. Xu, Shunsuke Shigaki, Yukiko Nakamura, Tai-Ting Lee, YuMin M. Loh, Emi Mishiro-Sato, Daniel F. Eberl, Matthew P. Su, Azusa Kamikouchi
2024年7月
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Recovery of extracellular vesicles from liquid samples using polyamine solution
Kikuchi Arizumi, Naruse Azumi, Nonaka Kenichi, Mori Motoki, Yamada Miyuu, Kano Keiko, Mishiro-Sato Emi, Tsutsumiuchi Kaname
Medical Mass Spectrometry 8 巻 ( 1 ) 頁： 35 - 42 2024年6月
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Isocitrate dehydrogenase 1 upregulation in urinary extracellular vesicles from proximal tubules of type 2 diabetic rats. 国際誌
Sei H, Hirade N, Kamiya K, Nakashima F, Yoshitake J, Kano K, Mishiro-Sato E, Kikuchi R, Uchida K, Shibata T
FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 38 巻 ( 10 ) 頁： e23688 2024年5月
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Ser/Leu-swapped cell-free translation system constructed with natural/in vitro transcribed-hybrid tRNA set. 国際誌
Fujino T, Sonoda R, Higashinagata T, Mishiro-Sato E, Kano K, Murakami H
Nature communications 15 巻 ( 1 ) 頁： 4143 - 4143 2024年5月
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Lipid droplets in Arabidopsis thaliana leaves contain myosin-binding proteins and enzymes associated with furan-containing fatty acid biosynthesis. 査読有り
Omata Y, Sato R, Mishiro-Sato E, Kano K, Ueda H, Hara-Nishimura I, Shimada TL
Frontiers in plant science 15 巻 頁： 1331479 2024年3月
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Measurement of the intracellular active metabolites of thiopurine drugs to evaluate the enzymatic activity of nudix hydrolase 15 in human blood samples. 査読有り 国際誌
Hitomi Okamoto, Yoichi Tanaka, Yoshio Shibagaki, Satoshi Kuronuma, Yusuke Miyatani, Satoko Umeda, Emi Mishiro-Sato, Osamu Takeuchi, Seisuke Hattori, Taku Kobayashi, Mitsuru Okuwaki
Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 1234 巻 頁： 123993 - 123993 2024年2月
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Data for LC-MS/MS analysis of peptides and proteins produced in the cell-free translation systems
Mishiro-Sato Emi, Fujino Tomoshige, Higashinagata Taito, Kano Keiko, Murakami Hiroshi
Journal of Proteome Data and Methods 6 巻 ( 0 ) 頁： 22 2024年
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TGF-β signaling promotes desmoid tumor formation via CSRP2 upregulation. 査読有り
Li Y, Fujishita T, Mishiro-Sato E, Kojima Y, Niu Y, Taketo MM, Urano Y, Sakai T, Enomoto A, Nishida Y, Aoki M
Cancer science 115 巻 ( 2 ) 頁： 401 - 411 2023年12月
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Decreased liver B vitamin-related enzymes as a metabolic hallmark of cancer cachexia 査読有り 国際誌
Kojima, Y, Mishiro-Sato, E, Fujishita, T, Satoh, K, Kajino-Sakamoto, R, Oze, I, Nozawa, K, Narita, Y, Ogata, T, Matsuo, K, Muro, K, Taketo, M, Soga, T, Aoki, A
Nat. Commun. 14 巻 ( 1 ) 頁： 6246 - 6246 2023年10月
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Palmitoylation-Dependent Small-Molecule Fluorescent Probes for Live-Cell Golgi Imaging. 査読有り
Sawada S, Yoshikawa M, Tsutsui K, Miyazaki T, Kano K, Mishiro-Sato E, Tsukiji S
ACS chemical biology 18 巻 ( 5 ) 頁： 1047 - 1053 2023年5月
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Discovery of 2,6-Dihalopurines as Stomata Opening Inhibitors: Implication of an LRX-Mediated H+-ATPase Phosphorylation Pathway 査読有り 国際誌
Ayaka Ueda, Yusuke Aihara, Shinya Sato, Keiko Kano, Emi Mishiro-Sato, Hiroyuki Kitano, Ayato Sato, Kazuhiro J. Fujimoto, Takeshi Yanai, Kazuma Amaike, Toshinori Kinoshita, Kenichiro Itami
ACS Chemical Biology 18 巻 ( 2 ) 頁： 347 - 355 2023年2月
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An efficient in‐gel digestion method on small amounts of protein sample from large intact gel pieces 査読有り
Keiko Kano, Saki Noda, Shinya Sato, Keiko Kuwata, Emi Mishiro‐Sato
SEPARATION SCIENCE PLUS 頁： 2200121 - 2200121 2023年1月
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Fujishita T, Kojima Y, Kajino-Sakamoto R, Mishiro-Sato E, Shimizu Y, Hosoda W, Yamaguchi R, Taketo MM, Aoki M
Cancer research 82 巻 ( 22 ) 頁： 4179 - 4190 2022年9月
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Silencing of SmgGDS, a Novel mTORC1 Inducer That Binds to RHEBs, Inhibits Malignant Mesothelioma Cell Proliferation. 査読有り 国際誌
Sato T, Mukai S, Ikeda H, Mishiro-Sato E, Akao K, Kobayashi T, Hino O, Shimono W, Shibagaki Y, Hattori S, Sekido Y
Molecular cancer research : MCR 19 巻 ( 5 ) 頁： 921 - 931 2021年5月
MISC 24
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がん悪液質における肝臓代謝変化の特徴
小島康, 三城恵美, 武藤誠, 曽我朋義, 青木正博
日本癌学会学術総会抄録集(Web)82nd 巻 2023年
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ヌクレオポリンのO-GlcNAc修飾異常を介した腫瘍進展メカニズムの解明
向井智美, 佐藤龍洋, 亀井保博, 加藤輝, 三城恵美, 三城恵美, 青木正博, 藪田紀一, 廣島健三, 廣島健三
日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)46th 巻 2023年
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ストレス条件下における葉の油滴の誘導機構と局在タンパク質の機能解析
岩井裕也, 三城恵美, 加納圭子, 尾亦雄斗, 島田貴士, 島田貴士, 島田貴士
日本植物生理学会年会(Web)64th 巻 2023年
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シロイヌナズナ排水組織から排出される溢泌液は分泌タンパク質を含む
吉田善葵, 三原衣織, 三城恵美, 佐藤伸哉, 加納圭子, 嶋田知生, 西村いくこ, 上田晴子, 上田晴子, 八木宏樹
日本植物生理学会年会(Web)64th 巻 2023年
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シロイヌナズナを用いた溢泌液に含まれる分泌タンパク質及び排水組織発生の解析
吉田善葵, 吉田善葵, 三原衣織, 三城恵美, 佐藤伸哉, 加納圭子, 嶋田知生, 西村いくこ, 近藤侑貴, 上田晴子, 上田晴子, 八木宏樹
日本植物学会大会研究発表記録(CD-ROM)87th 巻 2023年
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オルソケラトロジーレンズ装用による涙液中タンパク質の変動解析
清水友梨, 吉満円香, 平田ひかる, 加納圭子, 三城恵美, 角出泰造
質量分析総合討論会講演要旨集71st 巻 2023年
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ポリアミン類を用いた液状検体中に含まれる細胞外小胞の回収に関する検討
菊池有純, 菊池有純, 成瀬有純, 野中健一, 野中健一, 森基希, 加納圭子, 三城恵美, 堤内要
JSBMS Letters48 巻 ( Supplement ) 2023年
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水素をキャリアガスとして用いたGC/MSによるがん細胞のメタボローム解析
加納圭子, 佐藤伸哉, 佐藤龍洋, 三城恵美
JSBMS Letters48 巻 ( Supplement ) 2023年
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大腸がんの転移におけるRhoCの役割
藤下晃章, 三城恵美, 武藤誠, 青木正博, 青木正博
日本癌学会学術総会抄録集(Web)82nd 巻 2023年
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受容体様キナーゼDPK1の極性局在機構における酸性ループ領域の機能解析
吉成晃, 吉成晃, 三城恵美, 加納圭子, 桑田啓子, FROMMER Wolf B., FROMMER Wolf B., FROMMER Wolf B., 中村匡良
日本植物生理学会年会(Web)64th 巻 2023年
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Hippo経路の破綻した悪性中皮腫におけるO-GlcNAc修飾の亢進を標的とした治療の可能性
向井智美, 佐藤龍洋, 三城恵美, 三城恵美, 青木正博, 青木正博, 藪田紀一, 関戸好孝
日本癌学会学術総会抄録集(Web)81回 巻 頁： P - 3046 2022年9月
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がん悪液質のメタボロームおよびプロテオーム
小島康, 三城恵美, 武藤誠, 曽我朋義, 青木正博, 青木正博
日本癌学会学術総会抄録集(Web)81回 巻 頁： P - 3019 2022年9月
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トランスポゾンマウスを用いた大腸がん転移関連遺伝子の生体スクリーニング
藤下晃章, 梶野リエ, 三城恵美, 武藤誠, 青木正博, 青木正博
日本癌学会学術総会抄録集(Web)81st 巻 2022年
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がん悪液質の病態生理解明と治療戦略の基盤構築 マウスモデルを用いた網羅的解析
小島康, 三城恵美, 藤下晃章, 梶野リエ, 曽我朋義, 武藤誠, 青木正博
愛知県がんセンター年報(Web) ( 58 ) 2022年
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がんの発症・悪性化における微小環境の役割の解明 腸管腫瘍の悪性化におけるmTORC1経路の役割の解析
藤下晃章, 三城恵美, 梶野リエ, 新間秀一, 曽我朋義, 武藤誠, 青木正博
愛知県がんセンター年報(Web) ( 58 ) 2022年
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TGF-βシグナルはデスモイド形成を促進する
李宇, 李宇, 藤下晃章, 三城恵美, 武藤誠, 榎本篤, 西田佳弘, 青木正博, 青木正博
日本癌学会学術総会抄録集(Web)81st 巻 2022年
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悪性中皮腫におけるO-GlcNAc修飾異常を介した腫瘍進展メカニズムの解明
向井智美, 佐藤龍洋, 三城恵美, 三城恵美, 藪田紀一, 関戸好孝
日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)45th 巻 2022年
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転移の分子メカニズムの解明と予防・治療標的の探索 大腸がん自然発症・転移モデルを用いた転移メカニズムの解明と治療標的の同定
藤下晃章, 三城恵美, 梶野リエ, 小島康, 山口類, 武藤誠, 青木正博
愛知県がんセンター年報(Web) ( 58 ) 2022年
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デュアルオミクス解析で明らかとなったがん悪液質に伴う肝臓の代謝変化の概要
青木正博, 三城恵美, 曽我朋義, 小島康
日本癌学会学術総会抄録集(Web)80回 巻 頁： [S6 - 5] 2021年9月
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転移の分子メカニズムの解明と予防・治療標的の探索 大腸がん自然発症・転移モデルを用いた転移メカニズムの解明と治療標的の同定
藤下晃章, 三城恵美, 梶野リエ, 小島康, 山口類, 青木正博
愛知県がんセンター年報(Web) ( 57 ) 2021年
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悪性中皮腫におけるO-GlcNAc修飾異常を介した腫瘍進展メカニズムの解明
向井智美, 佐藤龍洋, 三城恵美, 青木正博, 藪田紀一, 関戸好孝
日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)44th 巻 2021年
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がん悪液質の病態生理解明と治療戦略の基盤構築 マウスモデルを用いた網羅的解析
小島康, 三城恵美, 藤下晃章, 梶野リエ, 曽我朋義, 武藤誠, 青木正博
愛知県がんセンター年報(Web) ( 57 ) 2021年
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大腸腫瘍組織における翻訳後修飾変化の解析
三城恵美, 藤下晃章, 小島康, 梶野リエ, 田中努, 田近正洋, 青木正博
日本プロテオーム学会大会プログラム・抄録集2021 (CD-ROM) 巻 2021年
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がんの発症・悪性化における微小環境の役割の解明 腸管腫瘍の悪性化におけるmTORC1経路の役割の解析
藤下晃章, 三城恵美, 梶野リエ, 新間秀一, 曽我朋義, 武藤誠, 青木正博
愛知県がんセンター年報(Web) ( 57 ) 2021年
科研費 7
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研究課題/研究課題番号：23K17449 2023年6月 - 2027年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(開拓)
柴田 貴広, 中島 史恵, 三城 恵美, 服部 浩之, 中島 史恵, 佐藤恵美, 服部 浩之
担当区分：研究分担者
疾患状態に起因する内因性代謝物や食品由来成分の代謝物の一部が、生体内のタンパク質に様々な付加体（アダクト）を形成していることが知られている。生体内タンパク質における代謝物アダクトの総体「代謝物アダクトーム」を明らかにすることができれば、ヒトの生体内環境や疾患状態を理解・評価できると考えられる。本研究では、代謝物アダクトーム解析法を確立し、生体内の状態や疾患状態を反映する代謝物アダクトの同定に挑戦する。
内因性あるいは外因性の分子の中には、タンパク質に対しアダクトを形成するものが報告されており、疾患状態に起因する内因性代謝物や食物由来成分の代謝物の一部が、タンパク質との反応性をもつアダクト形成物質として作用し、生体内のタンパク質に様々なアダクトを形成していることが考えられる。そこで本研究では、代謝物アダクトームの解析方法を確立し、生体の状態や疾患状態を反映する代謝物アダクトを同定することを目的としている。
ヒト酸化LDL中に形成される酸化コレステロールアダクトの網羅的解析を行い、酸化コレステロールがリジン残基に付加したシッフ塩基型付加体およびアミド型付加体の２種類の付加体を同定した。またこれらの付加体について、質量分析を用いた安定同位体希釈法による定量法を確立した。
ホモシステインの代謝物であるホモシステインチオラクトンに注目し、ヒト血清アルブミンにおける修飾を質量分析により解析した。その結果、ホモシステインチオラクトンにより修飾を受けやすいリジン残基を見出すことが出来た。また、ホモシステイン化リジンの定量方法として、過ギ酸酸化によりホモシステイン酸に変換したのちに質量分析で測定する方法を確立した。
マクロファージ様細胞が放出する細胞外微粒子に含まれるタンパク質の翻訳後修飾の解析を行った。その結果、アルギニン修飾体がリポ多糖刺激により増加することを見出した。また、カルボニル化タンパク質も顕著に増加することを明らかにした。
当初の計画通り、ヒト血清アルブミンにおけるアダクト解析は順調に進んでいる。また細胞外に放出されるタンパク質の解析にも着手している。
酸化コレステロール修飾リジン残基およびホモシステイン化リジン残基の定量法を用いて、生体サンプルにおけるこれらの付加体の存在量を評価する。また、ホモシステイン修飾血清アルブミンの機能変化を解析する。さらに、アルギニン修飾体の細胞外放出様式やその意義の解明を試みる。 -
研究課題/研究課題番号：22H02909 2022年4月 - 2025年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
青木 正博, 三城 恵美, 梶野 リエ, 小島 康, 藤下 晃章
担当区分：研究分担者
大腸がん幹細胞は転移・再発や治療抵抗性に関与することが知られているが、幹細胞性を制御・維持する分子機構は不明である。研究代表者らは、新規大腸がん自然発症・転移モデルの解析から、2つのシグナル経路が転移性大腸がんの幹細胞性や転移形成能に関与することを見出している。本研究では、大腸がん幹細胞がどのように可塑性や未分化性を維持して転移に寄与するのか、転移性大腸がんマウスモデルを用いてその分子機構を解明し、臨床検体を用いて検証する。転移性大腸がんに対する新しい治療戦略を確立する研究基盤の構築を目指す。
大腸がんに関連する4つの遺伝子（Ctnnb1、Kras、Trp53、 Smad4）の変異を腸管上皮細胞に散発的に導入することによって、腺がんを自然発症して肝臓に転移する、新規転移性大腸がんマウスモデル（CKPSマウス）の作出に成功している。そしてCKPSマウスの解析からcAMP/PKA/CREB-ALCAM経路、およびシグナル経路Xの活性化が大腸がんのがん幹細胞性の維持に関与し、転移形成能を正に制御することを見出している。これらの予備的検討結果に立脚し、令和4年度は以下の研究を実施した。
1. PKA-CREB-ALCAM経路の役割解明: CREBが制御する、大腸がん幹細胞性に関与する遺伝子を同定するため、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施した。CKPSマウス由来の大腸がん細胞株(CKPS細胞)を、通常（2次元）培養条件とがん幹細胞（3次元）培養条件で培養した後、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施したところ、がん幹細胞培養で増加する配列を約450個、減少する配列を約250個同定することができた。これらの近傍遺伝子リストから、がん幹細胞性およびALCAMの発現調節に関与する遺伝子の候補を絞り込む作業を行っている。
2. シグナル経路Xの役割解明: シグナル経路Xの下流で転移性大腸がんの幹細胞性・転移形成能に関与する分子を同定するため、経路Xの重要な構成因子をコードする遺伝子3つをそれぞれノックアウト（KO）したCKPS細胞、および対照CKPS細胞を用いた脾注肝転移モデルにより肝転移巣を形成させ、それぞれの転移巣組織を回収し、RNA-seq解析を実施した。これまでに、構成因子AをKOした細胞の肝転移巣において分泌に関わる遺伝子などの発現が上昇していることを確認している。現在これらの発現制御機構や転移における役割について解析を行っている。
新しい転移性大腸がんのマウスモデルの作出、およびcAMP/PKA/CREB経路が大腸がんの幹細胞性・転移能に寄与することについて、Cancer Research誌に論文発表した。また、CREBが大腸がんの幹細胞性・転移能に寄与するメカニズムを解明するため、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施し、複数の候補遺伝子を見つけることができた。シグナル経路Xについても、構成因子を個々にノックアウトした大腸がん細胞の肝転移巣を用いたRNA-seq解析を実施し、ノックアウトによって発現が変動する分子を見出すことができた。
リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析の結果を元に、がん幹細胞培養条件下および通常培養条件下において、ChIP-seqで同定したリン酸化CREBの標的遺伝子候補群についてオントロジー解析、パスウェイ解析等を実施し、PKA-CREB経路によるALCAM発現制御機構の解明を目指す。また、個別のリン酸化CREB標的遺伝子候補についても、ALCAMの発現やがん幹細胞性への関与を検討する。関与が示唆される遺伝子やシグナル経路については、CRISPR-Cas9によるノックアウトや阻害化合物を用いた実験により、その役割を検証する。同時に、PKA-CREB経路がALCAM非依存的に大腸がんの幹細胞性維持に関わる可能性についても検討する。また、シグナル経路X構成因子をノックアウトした大腸がん細胞による肝転移巣のRNA-seq解析結果については、in vitroにおける遺伝子発現データと比較しながら、得られた解析結果についてオントロジー解析、パスウェイ解析等を実施し、経路Xの下流で大腸がんの幹細胞性に関与する遺伝子や代謝経路の候補を絞り込む。さらに、TCGAなどの公共データベースや公開されている情報を元にin silicoベースでの解析を行い、ヒト大腸がんにおける候補遺伝子の発現について検討する。その後、大腸がん臨床検体（原発巣・転移巣）を用いた免疫染色やqRT-PCR、ウェスタンブロット等による発現解析によって検証を行う。 -
大腸がんにおけるRNA修飾酵素NAT10の役割と分子機構の解明
研究課題/研究課題番号：22K07201 2022年4月 - 2025年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
三城 恵美, 藤下 晃章, 梶野 リエ, 藤下 晃章, 梶野 リエ
担当区分：研究代表者
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
大腸がんの新しい治療標的を探索する目的で、家族性大腸腺腫症およびそのマウスモデルの腫瘍を用いて解析した。その中からアセチル化修飾に変化のあるRNA修飾酵素NAT10に着目し、さらにNAT10の阻害は大腸がん細胞の増殖を強く抑制することを見出していた。
本研究では、NAT10が腫瘍組織内で活性化していることを明らかにし、大腸がん細胞の生存・増殖に関与する分子メカニズムを解明することを目的としている。本研究成果がNAT10阻害による大腸がん新規治療の開発につながることが期待される。
大腸がんの新しい治療標的を探索する目的で、家族性大腸腺腫症およびそのマウスモデルの腫瘍を用いて解析し、その中から翻訳後修飾のひとつであるアセチル化修飾に着目した。さらにアセチル化修飾に変化のあるRNA修飾酵素NAT10に着目し、NAT10が腫瘍組織内で活性化していることを明らかにし、大腸がん細胞の生存・増殖に関与する分子メカニズムを解明することを目的とし、本研究成果がNAT10阻害による大腸がん新規治療の開発につながることを期待している。
A）NAT10のRNAアセチラーゼ活性が大腸がん細胞の生存・増殖に果たす役割の検討
研究分担者の多大なる協力の下、家族性大腸腺腫症から作製されたオルガノイドでもドキシサイクリン誘導性NAT10の発現抑制系の作製に取り組んでいる。
B) NAT10のリジンアセチル化の機能解析
・アセチル化部位の変異体を作製した。研究分担者の多大なる協力の下、アセチル化サイトのリジン残基(K: 正電荷) をアセチル化ミミックとしてグルタミン残基(Q: 中性)へ、コントロールとして同じ正電 荷でアセチル化されないアルギニン残基(R: 正電荷)に置換した変異体を作製した。
・NAT10のリジンアセチル化部位特異的抗体の作製を実施した。NAT10のリジンアセチル化部位を検出できるよう、NAT10のアセチル化修飾付近の配列において非アセチル化ペプチドは認識せず、アセチル化ペプチド特異的に認識する抗体を作製し、ELISA法ではしっかり区別できる抗体を作製することができた。しかし、ウエスタンブロッティングや免疫沈降法に対して本リジンアセチル化部位特異的抗体を用いると特異的な反応が見られず、NAT10自体にも反応しない抗体であることが分かってしまった。
現職での業務が多く、十分な解析時間が取れていない状況ではあるものの、プロテオミクスの解析技術は安定してきた。
研究分担者の多大なる協力の下、NAT10のアセチル化部位の変異体を各種作製することができ、さらにNAT10のリジンアセチル化部位特異的抗体の作製を実施した。ELISA法ではしっかり区別できる抗体を作製することができたものの、ウエスタンブロッティングや免疫沈降に対しては、様々な検証も虚しく残念ながらリジンアセチル化にもNAT10にも反応がない抗体となってしまった。検証の際には作製したNAT10リジンアセチル化部位変異体とWTを用いて比較したり、NAT10ノックアウト細胞を用いたりGFPタグ付きNAT10-WTをレスキューした場合も変動がなかった。抗体作製は狙い通りにいかないこともあるため、他のアプローチに変更する。NAT10のアセチル化部位の変異体はきちんとできているので別の方法で検証する。
昨年度構築できた大腸がん細胞株だけでなく、家族性大腸腺腫症由来のオルガノイドについてもドキシサイクリン誘導性NAT10発現抑制系の構築に着手している状態である。
以上のことから、おおむね順調に進捗していると判断した。
プロテオミクスに関しては、質量分析装置を用いた前処理や測定・解析の方法はかなり習熟させることができてきた。
抗体作成は難しかったが、大腸がん細胞におけるドキシサイクリン誘導性NAT10発現抑制系の作製を発展させた家族性大腸腺腫症患者由来のオルガノイドに対しても準備が進んでいる。また、作製した様々な変異体も作製できていることから、これらの細胞系を用いたプロテオミクスによる機能解明を進める予定にしている。リン酸化やアセチル化、メチル化などの翻訳後修飾変化を検出できる環境が整っているため、解析を進める予定にしている。
解析技術についてノウハウを持っている方とのネットワークも広げられたので、ますます知識を深めているところであり、得られたデータを解釈する技術が上がっていると思っている。
愛知県がんセンターとの物理的な距離はどうしてもあるが、訪問するだけでなくこちらに訪問していただく機会を増やしたり、より連携を深めていきたいと考えている。 -
研究課題/研究課題番号：23K24170 2022年4月 - 2025年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
青木 正博, 佐藤恵美, 梶野 リエ, 小島 康, 藤下 晃章
担当区分：研究分担者
大腸がん幹細胞は転移・再発や治療抵抗性に関与することが知られているが、幹細胞性を制御・維持する分子機構は不明である。研究代表者らは、新規大腸がん自然発症・転移モデルの解析から、2つのシグナル経路が転移性大腸がんの幹細胞性や転移形成能に関与することを見出している。本研究では、大腸がん幹細胞がどのように可塑性や未分化性を維持して転移に寄与するのか、転移性大腸がんマウスモデルを用いてその分子機構を解明し、臨床検体を用いて検証する。転移性大腸がんに対する新しい治療戦略を確立する研究基盤の構築を目指す。
1. PKA-CREB-ALCAM経路の役割解明: 転移性大腸がんマウスモデル(CKPSマウス)由来の大腸がん細胞株(CKPS細胞)において、PKA-CREB経路の下流でALCAMの発現を制御する分子を探索するため、前年度までにリン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施した。本年度はこのデータを元に、リン酸化CREB標的遺伝子候補の解析を実施した。通常（２次元）培養条件と比較して、リン酸化CREBおよびALCAMのレベルが上昇するがん幹細胞（3次元）培養条件下において発現が上昇する遺伝子群をRNA-seq解析により同定し、ChIP-seq解析結果と統合した。がん幹細胞培養条件下で発現上昇するリン酸化CREB標的遺伝子候補についてエンリッチメント解析を実施したところ、血管・血液、アポトーシス抑制に関連する情報などが浮上した。さらにCrebノックアウト(KO)細胞を用いて標的遺伝子を絞り込んでいる。候補の一つであるBmf遺伝子をKOしたが、転移形成能に顕著な影響を与えなかったため、その他の候補遺伝子について解析を進めている。
2. シグナル経路Xの役割解明: 本年度は、シグナル経路Xの重要な構成因子AをKOしたCKPS細胞のRNA-seq解析およびプロテオーム解析を実施した。エンリッチメント解析から、リボゾーム関連の遺伝子・タンパク発現の低下がAをKOしたCKPS細胞で認められた。分泌細胞の特徴を示唆する分子群に加えて、炎症に関連する遺伝子群の発現が上昇していた。また、AをKOした細胞において、重要な細胞内シグナル経路に関与する分子群の発現低下が確認された。
3. 大腸がん臨床検体を用いた検証: 1.および2.で得られた結果について、TCGAの公共データベースを元にin silicoベースでの解析を行うとともに、患者由来オルガノイドを用いた検証を進めている。
「1. PKA-CREB-ALCAM経路の役割解明」に関して、リン酸化CREB標的遺伝子候補群から、RNA-seq解析の結果を加味してALCAMの発現制御に関与する遺伝子の同定を目指しているが、まだ絞り切れていないことから、「3． 大腸がん臨床検体を用いた解析」のうち、大腸がん臨床検体を用いた発現解析がやや遅れている。一方で、「2. シグナル経路Xの役割解明」については、その重要な構成因子Aをノックアウトした細胞のRNA-seq解析、プロテオーム解析から重要な知見が得られており、「3． 大腸がん臨床検体を用いた解析」のうち、大腸がん細胞株やオルガノイドを用いた検証でも幹細胞性におけるAの重要性が強く示唆されている。そのため、全体としてはおおむね順調に進展していると考えている。
引き続きリン酸化CREB標的遺伝子候補の同定作業を実施する。CRISPR-Cas9により残りのリン酸化CREB標的遺伝子候補のノックアウト細胞を樹立し、脾注肝転移モデルによる転移巣の形成能および病理組織像を対照のCKPS細胞と比較する。同時に作成したCREB標的遺伝子ノックアウト細胞を用いてALCAMの発現やがん幹細胞性への関与を検討することで、PKA-CREB経路によるALCAM発現制御機構の解明を目指す。また、PKA-CREB経路がALCAM非依存的に大腸がんの幹細胞性維持に関わる可能性についても検討する。
また、シグナル経路Xについては、これまでに得られた結果をもとに、その構成因子AおよびBの下流で大腸がんの幹細胞性に関与する候補分子のノックアウトおよび阻害薬による介入を実施し、その特定を目指す。また、シグナル経路Xは代謝制御への関与が示唆されるため、同経路に介入したCKPS細胞を用いてメタボローム解析を実施する。さらに、TCGAなどの公共データベースや公開されている情報を元にin silicoベースでの解析を続け、ヒト大腸がんにおける候補遺伝子の発現について検討するとともに、大腸がん臨床検体（原発巣・転移巣）を用いた免疫染色やqRT-PCR、ウェスタンブロット等による発現解析によって検証を行う。 -
研究課題/研究課題番号：21K07140 2021年4月 - 2024年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
小島 康, 三城 恵美, 佐藤恵美
担当区分：研究分担者
がん悪液質は、体重減少・骨格筋萎縮・食思不振を主徴とする臨床症候群である。進行がん患者の約8割が、悪液質を発症し、世界では年間900万人近くのがん患者が悪液質を発症していると推定されている。現在、悪液質の本態は不明で、実効性のある早期診断方法や治療介入法が存在しない。本研究では、悪液質モデル動物および臨床検体を組み合わせ、総合的に解析して悪液質治療薬の開発基盤を構築する。
がん悪液質モデルマウスを解析したところ、悪液質肝臓ではNAD（nicotinamide adenine dinucleotide）濃度が半減して、そしてNAD分解酵素であるCD38の発現が上昇することが特徴的であった。NAD前駆体を含むビタミンB製剤を投与したが、がん悪液質モデルマウスの生存期間は延長しなかった。CD38阻害剤Compound 78cはSEKIがん悪液質モデルマウスの肝臓および骨格筋重量を増加させることが示唆された。マウスがん悪液質モデルおよびヒト胃がん悪液質患者血液ではNAD前駆体であるトリプトファン濃度の低下を認めた。
がん悪液質は、進行性の体重減少・骨格筋萎縮・食思不振を主徴とする複合的な代謝性症候群である。多くの進行がん患者が、悪液質を発症し、がん悪液質はがん患者の約20％にとって直接死因であるとされる。紀元前の文献にも、悪液質に関する記録が残されているが、現在に至るまで、悪液質の本態は不明である。がん悪液質の本態は依然として不明で、実効性のある早期診断方法や治療介入法の開発が望まれている。本研究成果はがん悪液質の代謝学的側面の解明に関して一定の貢献をすることが期待される。 -
研究課題/研究課題番号：19K07656 2019年4月 - 2022年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
三城 恵美
担当区分：研究代表者
配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）
研究代表者は、大腸がんの新たな治療標的となりうる分子やシグナル伝達経路を探索するため、大腸がんマウスモデルを用いたプロテオーム解析や翻訳後修飾（Post-translational modification: PTM）解析を行ってきた。その中で、タンパク発現だけでなく、アシル化修飾が、大腸がんの初期病変である良性腺腫の段階で大きく変動していることを見出した。新規大腸がん治療法の開発を指向して、大腸がん腫瘍組織におけるアシル化修飾の変動の生物学的意義を解明することを目的としている。
マウスモデルで見つかったタンパクおよびそのPTM変化の臨床的重要性を検証し治療標的を探索するため、家族性大腸腺腫症familial adenomatous polyposis (FAP）患者の大腸腫瘍組織を用いてプロテオーム解析およびアシル化関連のPTM網羅解析を行って比較した。プロテオーム解析によって、ヒト・マウスのいずれにおいても、大腸腫瘍組織では大腸正常組織と比較して核やリボゾーム関連タンパク群の増加、ミトコンドリア関連タンパクの減少が認められ、アシル化PTM網羅解析では、アセチル化タンパクについて、ヒト・マウスに共通した変化を腫瘍組織に認めた。
大腸腫瘍形成に伴うタンパクアセチル化の変動を制御する分子を同定するため、候補分子の絞り込みを行なった。現在までに候補分子の組織局在がアセチル化修飾変化と一致すること、阻害薬によりFAP患者腫瘍由来オルガノイドや大腸がん細胞株の増殖を抑制すること、さらに候補分子のノックダウンにより大腸がん細胞株の増殖を抑制することを確認した。以上の結果から、大腸がんの多段階発がんの初期過程から変動するタンパク翻訳後修飾の解析から大腸がん治療の新規治療標的候補を同定した。 -
マウスモデルを用いた大腸がん転移の分子機序解明と予防・治療標的の同定
研究課題/研究課題番号：18H02686 2018年4月 - 2022年3月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
青木 正博, 三城 恵美, 梶野 リエ, 小島 康, 藤下 晃章, 佐久間 圭一朗, 佐藤恵美, 梶野 リエ, 小島 康, 藤下 晃章, 佐久間 圭一朗
担当区分：研究分担者
①HNRNPLLの下流標的分子および発現制御機構の解明
HNRNPLLのスプライシング標的遺伝子CTNND1 (p120 cateninをコード）についてヒト大腸がん細胞株を用いて検討し、HNRNPLLがエクソン20(エクソンB)のinclusionを促進することを見出した。エクソン20は核外移行シグナル配列(NES)を内包し、エクソン20を含むアイソフォーム3ABの一部が核に局在する一方、エクソン20を含まないアイソフォーム3Aは核に局在しないことを確認した。また、大腸がん臨床検体の浸潤先端においてp120 cateninが核に局在するがん細胞が一部存在することを見出した。一方、HNRNPLLの転写調節機構については、関与する転写因子の候補を7つ同定した。shRNAまたはsiRNAによるノックダウン効率が不十分であったため、CRISPR-Cas9システムを用いてノックアウト細胞を作成中である。
②新規大腸がん自然転移モデルを用いたマルチオミクス解析による転移機構の解明
大腸がん自然転移モデルである villin-CreERT2;Ctnnb+/loxEX3;Kras+/LSLG12D;Trp53lox/lox;Smad4lox/lox複合変異マウス(VCKPSマウス)の原発巣と肝転移巣、 および周辺の腸管正常部と肝臓正常部を用いて、比較定量プロテオーム解析とサイトカインアレイ解析を実施し、大腸がん原発巣と転移巣で発現が上昇しているタンパクを複数同定した。特にプロテオーム解析で同定したFHL2やHMGA2は、その発現が大腸がん患者の予後や転移と相関することが既に報告されており、臨床検体を用いた解析によりこれらの発現が肝転移巣で上昇していることを確認できた。この結果は我々の大腸がん自然転移モデルの臨床的妥当性を担保するものであり、引き続き同定したタンパクの転移における役割を検証する。