国名：日本国

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担当区分：研究分担者 

疾患状態に起因する内因性代謝物や食品由来成分の代謝物の一部が、生体内のタンパク質に様々な付加体（アダクト）を形成していることが知られている。生体内タンパク質における代謝物アダクトの総体「代謝物アダクトーム」を明らかにすることができれば、ヒトの生体内環境や疾患状態を理解・評価できると考えられる。本研究では、代謝物アダクトーム解析法を確立し、生体内の状態や疾患状態を反映する代謝物アダクトの同定に挑戦する。

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担当区分：研究分担者 

大腸がん幹細胞は転移・再発や治療抵抗性に関与することが知られているが、幹細胞性を制御・維持する分子機構は不明である。研究代表者らは、新規大腸がん自然発症・転移モデルの解析から、2つのシグナル経路が転移性大腸がんの幹細胞性や転移形成能に関与することを見出している。本研究では、大腸がん幹細胞がどのように可塑性や未分化性を維持して転移に寄与するのか、転移性大腸がんマウスモデルを用いてその分子機構を解明し、臨床検体を用いて検証する。転移性大腸がんに対する新しい治療戦略を確立する研究基盤の構築を目指す。
大腸がんに関連する4つの遺伝子（Ctnnb1、Kras、Trp53、 Smad4）の変異を腸管上皮細胞に散発的に導入することによって、腺がんを自然発症して肝臓に転移する、新規転移性大腸がんマウスモデル（CKPSマウス）の作出に成功している。そしてCKPSマウスの解析からcAMP/PKA/CREB-ALCAM経路、およびシグナル経路Xの活性化が大腸がんのがん幹細胞性の維持に関与し、転移形成能を正に制御することを見出している。これらの予備的検討結果に立脚し、令和4年度は以下の研究を実施した。
1. PKA-CREB-ALCAM経路の役割解明: CREBが制御する、大腸がん幹細胞性に関与する遺伝子を同定するため、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施した。CKPSマウス由来の大腸がん細胞株(CKPS細胞)を、通常（2次元）培養条件とがん幹細胞（3次元）培養条件で培養した後、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施したところ、がん幹細胞培養で増加する配列を約450個、減少する配列を約250個同定することができた。これらの近傍遺伝子リストから、がん幹細胞性およびALCAMの発現調節に関与する遺伝子の候補を絞り込む作業を行っている。
2. シグナル経路Xの役割解明: シグナル経路Xの下流で転移性大腸がんの幹細胞性・転移形成能に関与する分子を同定するため、経路Xの重要な構成因子をコードする遺伝子3つをそれぞれノックアウト（KO）したCKPS細胞、および対照CKPS細胞を用いた脾注肝転移モデルにより肝転移巣を形成させ、それぞれの転移巣組織を回収し、RNA-seq解析を実施した。これまでに、構成因子AをKOした細胞の肝転移巣において分泌に関わる遺伝子などの発現が上昇していることを確認している。現在これらの発現制御機構や転移における役割について解析を行っている。
新しい転移性大腸がんのマウスモデルの作出、およびcAMP/PKA/CREB経路が大腸がんの幹細胞性・転移能に寄与することについて、Cancer Research誌に論文発表した。また、CREBが大腸がんの幹細胞性・転移能に寄与するメカニズムを解明するため、リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析を実施し、複数の候補遺伝子を見つけることができた。シグナル経路Xについても、構成因子を個々にノックアウトした大腸がん細胞の肝転移巣を用いたRNA-seq解析を実施し、ノックアウトによって発現が変動する分子を見出すことができた。
リン酸化CREB抗体を用いたChIP-seq解析の結果を元に、がん幹細胞培養条件下および通常培養条件下において、ChIP-seqで同定したリン酸化CREBの標的遺伝子候補群についてオントロジー解析、パスウェイ解析等を実施し、PKA-CREB経路によるALCAM発現制御機構の解明を目指す。また、個別のリン酸化CREB標的遺伝子候補についても、ALCAMの発現やがん幹細胞性への関与を検討する。関与が示唆される遺伝子やシグナル経路については、CRISPR-Cas9によるノックアウトや阻害化合物を用いた実験により、その役割を検証する。同時に、PKA-CREB経路がALCAM非依存的に大腸がんの幹細胞性維持に関わる可能性についても検討する。また、シグナル経路X構成因子をノックアウトした大腸がん細胞による肝転移巣のRNA-seq解析結果については、in vitroにおける遺伝子発現データと比較しながら、得られた解析結果についてオントロジー解析、パスウェイ解析等を実施し、経路Xの下流で大腸がんの幹細胞性に関与する遺伝子や代謝経路の候補を絞り込む。さらに、TCGAなどの公共データベースや公開されている情報を元にin silicoベースでの解析を行い、ヒト大腸がんにおける候補遺伝子の発現について検討する。その後、大腸がん臨床検体（原発巣・転移巣）を用いた免疫染色やqRT-PCR、ウェスタンブロット等による発現解析によって検証を行う。

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担当区分：研究代表者 

配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）

大腸がんの新しい治療標的を探索する目的で、家族性大腸腺腫症およびそのマウスモデルの腫瘍を用いて解析した。その中からアセチル化修飾に変化のあるRNA修飾酵素NAT10に着目し、さらにNAT10の阻害は大腸がん細胞の増殖を強く抑制することを見出していた。
本研究では、NAT10が腫瘍組織内で活性化していることを明らかにし、大腸がん細胞の生存・増殖に関与する分子メカニズムを解明することを目的としている。本研究成果がNAT10阻害による大腸がん新規治療の開発につながることが期待される。
大腸がんの新しい治療標的を探索する目的で、家族性大腸腺腫症およびそのマウスモデルの腫瘍を用いて解析し、その中から翻訳後修飾のひとつであるアセチル化修飾に着目した。さらにアセチル化修飾に変化のあるRNA修飾酵素NAT10に着目し、さらにNAT10の阻害は大腸がん細胞の増殖を強く抑制することを見出していた。
本研究では、NAT10が腫瘍組織内で活性化していることを明らかにし、大腸がん細胞の生存・増殖に関与する分子メカニズムを解明することを目的とし、本研究成果がNAT10阻害による大腸がん新規治療の開発につながることを期待している。
A）NAT10のRNAアセチラーゼ活性が大腸がん細胞の生存・増殖に果たす役割の検討
研究分担者の多大なる協力の下、大腸がん細胞におけるドキシサイクリン誘導性NAT10の発現抑制系の作製に成功し、ドキシサイクリン誘導的にNAT10の発現を抑制したところ、細胞増殖の抑制を確認することができた。さらに、NAT10発現抑制細胞株のRNAを単離し、RNAアセチル化シチジン（ac4C）認識抗体やそれ以外のRNAメチル化認識抗体を用いて検出したところ、実際にRNAアセチル化シチジンが特異的に減少していることも確認でき、逆に発現抑制を解除すると28Sから回復するが増殖抑制はなかなか回復しないことを確認した。これらのNAT10発現調節細胞をプロテオーム解析することにより、細胞内で起こっている現象を解明して腫瘍化メカニズムを明らかにしようとしており、核や転写因子に関与するタンパク質に変動が見られるような興味深いタンパク質で有意に差のある結果を得つつある。現在は、プロテオーム解析上の前処理や測定の最適化に取り組み、新しい解析手法を検討しながらより良い結果を得られるよう工夫を重ねている。
新しい所属先での業務が多く、十分な解析時間が取れていない状況ではあるものの、プロテオミクスの技術習得は格段に進んでいる状況であります。
本研究の計画である、A-1の生物由来試料を用いた活性測定系構築としては、市販の抗体を用いた修飾RNAの測定系を構築することができました。研究分担者の多大なる協力の下、A-2である大腸がん細胞株のドキシサイクリン誘導性NAT10発現抑制系の構築にも成功しました。これらの系を用いて、NAT10を発現抑制すると、RNAのac4c修飾が激減し、増殖の抑制が生じることも検出し、逆に発現抑制を解除すると28Sから回復していることを確認したが増殖抑制作用はなかなか回復しないことを確認しました。その細胞を用いて我々が得意なプロテオーム解析を実施したところ、核や転写因子に関与するタンパク質に変動が見られることを確認しました。
以上のことから、おおむね順調に進捗していると判断しました。
現在は直接質量分析装置を扱い、プロテオミクスを実施できる部署を運営しております。プロテオミクスの技術革新は目覚ましく、昨年取り入れたSP3法では、これまで禁忌だったSDSを使って完全に可溶化したサンプルからのトリプシン消化が可能となり、簡便さと結果の安定性を手に入れました。また、測定法であるDIA法は、DDA測定法のみだった頃に比べてタンパク質の同定数を格段に増やしており、何をターゲットとするかで測定法ごとに使い分けをしながら測定しております。これからも、プロテオミクスの条件の最適化を進め、より良いデータが得られるように改善しつつ、測定して得られたデータの解析技術向上にも取り組みたいと思い、ネットワークを広げているところです。
愛知県がんセンターとの物理的な距離が少しできてしまったので、できるだけ頻繁にコンタクトを取れるようにwebツールを使ったり訪問したりしながら、連携を深めていきたいと考えております。

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担当区分：研究分担者 

がん悪液質は、体重減少・骨格筋萎縮・食思不振を主徴とする臨床症候群である。進行がん患者の約8割が、悪液質を発症し、世界では年間900万人近くのがん患者が悪液質を発症していると推定されている。現在、悪液質の本態は不明で、実効性のある早期診断方法や治療介入法が存在しない。本研究では、悪液質モデル動物および臨床検体を組み合わせ、総合的に解析して悪液質治療薬の開発基盤を構築する。
多くの進行がん患者は、骨格筋萎縮を主徴とする「がん悪液質」に苦しむことが多い。しかし、その病態生理は不明な点が多く、根本的な治療方法は開発されていない。申請者らは、がん悪液質モデルマウスを解析したところ、骨格筋より、むしろ肝臓で激しい代謝変化が生じることを見出した。さらに悪液質肝臓では代謝産物であるNAD（nicotinamide adenine dinucleotide）濃度が半減すること、そしてNAD消費酵素であるNNMTおよびCD38の発現が上昇することを観察した。NADは、酸化還元反応の補酵素として、またSirtuinやPARPなど重要な生理機能に関わる酵素の基質として働く代謝物である。近年、NADの細胞内濃度減少は、ヒトの骨格筋萎縮や神経変性と強く相関することを示唆する報告が相次いでいる。NNMT (nicotinamide N-methyltransferase)は、NAD合成の原材料であるNAM（nicotinamide）をMNA(1-methyl-nicotinamide)に変換する。MNAは尿中に排出されるので、NNMT活性上昇は、NAM濃度低下、NAD合成抑制につながると想定されている。CD38は、NADを分解する酵素である。CD38 ノックアウトマウスでは、生体のNAD濃度が劇的に上昇することが報告されている（肝臓では10倍近く上昇）。この表現型は、CD38が、生体でNAD濃度をコントロールしている主要酵素であることを強く示唆している。NNMTおよびCD38は、NADサルベージ回路から、それぞれNAMおよびNADを取り除き、生体の総NAD量を減少する方向に作用する。本研究では、NNMT阻害剤およびCD38阻害剤を悪液質モデルマウスに投与して検証して、悪液質におけるNAD代謝に与える影響、および悪液質治療薬としての可能性を探ることを目的とする
先行して取り組んでいたApc/Smad4/Nnmt-/-の繁殖効率が著しく不良で、Apc/Smad4/Nnmt-/-による解析は困難であると判断して中止した。C57BL/6由来のLLCおよびB16細胞株移植を用いた悪液質モデルは、先行論文が多数ある。その作出を試みたが、申請者の研究室ではうまく悪液質を発症させることができなかった。そのため研究室内で樹立されていたC57BL/6由来の大腸がん細胞株を移植、培養尾のサイクルを複数回実施したところ、悪液質症状の発症するサブクローンを得た。またCD38/CD157ノックアウトマウスも入手して繁殖を開始した。さらに大腸がん細胞株のバックアップとして、悪液質発症が可能であるC57BL/6由来のマウス膵がん細胞株も入手した。
手元にあるマウス大腸がん細胞株、マウス膵臓がん細胞株を用いた悪液質モデルの条件検討を慎重に実施して、NnmtおよびCD38/CD157ノックアウトマウスへの移植実験に移行する。またNnmtおよびCD38阻害剤の薬理実験のセットアップにも着手する。

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担当区分：研究代表者 

配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）

研究代表者は、大腸がんの新たな治療標的となりうる分子やシグナル伝達経路を探索するため、大腸がんマウスモデルを用いたプロテオーム解析や翻訳後修飾（Post-translational modification: PTM）解析を行ってきた。その中で、タンパク発現だけでなく、アシル化修飾が、大腸がんの初期病変である良性腺腫の段階で大きく変動していることを見出した。新規大腸がん治療法の開発を指向して、大腸がん腫瘍組織におけるアシル化修飾の変動の生物学的意義を解明することを目的としている。
マウスモデルで見つかったタンパクおよびそのPTM変化の臨床的重要性を検証し治療標的を探索するため、家族性大腸腺腫症familial adenomatous polyposis (FAP）患者の大腸腫瘍組織を用いてプロテオーム解析およびアシル化関連のPTM網羅解析を行って比較した。プロテオーム解析によって、ヒト・マウスのいずれにおいても、大腸腫瘍組織では大腸正常組織と比較して核やリボゾーム関連タンパク群の増加、ミトコンドリア関連タンパクの減少が認められ、アシル化PTM網羅解析では、アセチル化タンパクについて、ヒト・マウスに共通した変化を腫瘍組織に認めた。
大腸腫瘍形成に伴うタンパクアセチル化の変動を制御する分子を同定するため、候補分子の絞り込みを行なった。現在までに候補分子の組織局在がアセチル化修飾変化と一致すること、阻害薬によりFAP患者腫瘍由来オルガノイドや大腸がん細胞株の増殖を抑制すること、さらに候補分子のノックダウンにより大腸がん細胞株の増殖を抑制することを確認した。以上の結果から、大腸がんの多段階発がんの初期過程から変動するタンパク翻訳後修飾の解析から大腸がん治療の新規治療標的候補を同定した。

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