国名：日本国

国名：アメリカ合衆国

国名：日本国

国名： 日本国

備考： 博士課程後期

団体区分：学協会

担当区分：研究分担者  資金種別：競争的資金

配分額：2000000円

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：4810000円 （ 直接経費：3700000円 、 間接経費：1110000円 ）

ユニークな形質を持つ生物は、それらが独自の遺伝子をゲノム中に獲得することで進化したと考えられてきた。ところが、発光魚キンメモドキは、発光に必要な酵素遺伝子をゲノム中に持たず、餌であるウミホタルから発光酵素(ルシフェラーゼ)を獲得していることが、 申請者の研究により明らかとなった。「餌由来のタンパク質が消化されずに特定の器官の細胞に取り込まれ、さらに、本来の酵素機能が保持される」現象（盗タンパク質現象）の取込みの分子・細胞生物学的メカニズムおよび進化的起源は未知である。本研究では、キンメモドキにおいて餌由来タンパク質を細胞内に取込む仕組みの解明 と本現象がみられる新たな生物種の発見を目指す。

担当区分：研究分担者  資金種別：競争的資金

本研究では、ハタンポ科魚類を形態学的に精査し、分子系統学的手法を用いて系統関係を明らかにすることで、分類学的混乱を整理することを目的としている。また、現行の属に単系統性が認められないことから、属の再定義をおこなう。さらに、ハタンポ科魚類には「盗タンパク質」により発光能力をもつ種が存在しているが、その系統学的位置を形態・分子の両面から明らかにすることにより、本科魚類がどの進化的過程のなかで発光能力を獲得したのかを推定することを最終目標とする。本研究で得られる知見は、ハタンポ科の分類系統に貢献するだけでなく、発光生物の進化的な起源や分子生物学的な仕組みの解明に貢献すると考えられる。

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：2860000円 （ 直接経費：2200000円 、 間接経費：660000円 ）

ユニークな形質を持つ生物は、それらが独自の遺伝子をゲノム中に進化させてきたと考えられてきた。ところが、発光魚キンメモドキは、発光に必要な酵素遺伝子をゲノム中に持たず、餌であるウミホタルからルシフェラーゼタンパク質を獲得していることが、申請者の研究により明らかとなった。餌由来のタンパク質を利用する「盗タンパク質」現象は、申請者により初めて発見されたものであり、その取り込みの分子・細胞生物学的・生理学的メカニズム及び進化的起源は未知である。本研究では、キンメモドキにおいて餌由来タンパク質を消化せずに細胞内に取込む仕組みの解明と本現象がみられる新たな生物種の発見を目指す。
発光魚キンメモドキParapriacanthus ransonnetiは、トガリウミホタルCypridina noctilucaのルシフェラーゼタンパク質を発光器に取り込むが、その動態は不明である。また、免疫組織化学による染色像より発光細胞の細胞質にルシフェラーゼが存在することから、膜介在性の取り込み機構などによりルシフェラーゼが取り込まれていると予想される。すなわち、膜に局在するトガリウミホタルルシフェラーゼ受容体の存在を想定して、これを同定することを目指す。
本年度はルシフェラーゼ受容体を分析するために、リガンドとなるトガリウミホタルルシフェラーゼのタンパク質異種発現を行った。トガリウミホタルルシフェラーゼは複雑な高次構造を持つため、大腸菌を用いては発現することができず、酵母Pichia pastorisを用いて発現実験を行なった。リガンドタンパク質は大量に必要となると予想されるため、発現条件やタンパク質精製の検討を行なった。その結果、ワンステップの精製で培養液あたりの収量を2-4 mg/Lまで向上した条件を見出し、これを採用した。現在は、トガリウミホタルルシフェラーゼの大量発現を行なっており、今後、これを用いてルシフェラーゼ受容体の同定を進める。
一方で、キンメモドキは昨年度に引き続き不漁となった。全国の漁業関係者や水族館関係者から情報収集をおこなったが、このような大規模な不漁はここ数十年で初めてのことであった。現在は、SCUBAダイビングによる分布調査を検討しており、本年度はその準備として潜水士の資格を取った。次年度以降も、不漁が続く可能性を考慮した研究計画の練り直しが必要だと考えられる。
本年度はルシフェラーゼ受容体を分析するために、リガンドとなるトガリウミホタルルシフェラーゼのタンパク質異種発現を行った。トガリウミホタルルシフェラーゼは複雑な高次構造を持つため、大腸菌を用いては発現することができず、酵母Pichia pastorisを用いて発現実験を行なった。リガンドタンパク質は大量に必要となると予想されるため、発現条件やタンパク質精製の検討を行なった。その結果、ワンステップの精製で培養液あたりの収量を2-4 mg/Lまで向上した条件を見出し、これを採用した。本研究費を使用して、培養震盪器を購入し本年度の成果が得られた。現在は、トガリウミホタルルシフェラーゼの大量発現を行なっており、今後、これを用いてルシフェラーゼ受容体の同定を進める。
一方で、キンメモドキは環境変動や海峡の変化の影響をうけてか、昨年度に引き続き不漁となった。全国の漁業関係者や水族館関係者から情報収集をおこなったが、このような大規模な不漁はここ数十年で初めてのことであった。現在は、SCUBAダイビングによる分布調査を検討しており、本年度はその準備として潜水士の資格を取った。次年度以降も、不漁が続く可能性を考慮した研究計画の練り直しが必要だとかんがえられる。
本年度検討したタンパク質発現条件を用いて、トガリウミホタルルシフェラーゼを大量に調製する。これを用いて受容体の同定を進める。
研究材料であるキンメモドキの生体の調達は、不漁が続く場合より難しくなると予想される。関係者の聞き取りからは、このような全国規模の不漁はキンメモドキに限らずその他おおくの魚種についてもあてはまっており、これまでの経験からは漁の状況がまったく予想ができなくなっていることが明らかになった。定置網漁では実際の生物相を把握することが難しいため、より直接的な方法として、今後自ら潜水調査をおこう。さらに、各地のダイバーとの情報交換を進めることで分布の調査をすすめる。不漁が継続する場合は、比較トランスクリプトーム解析などを併用し、受容体タンパク質の同定を目指す。そのためには、詳細な発光器や非発光器の細胞レベルでの組織学的が必要になるが、そのような研究例は全くない。キンメモドキの組織学的知見を得るために、薄切切片の作成や一般染色・免疫染色を行い、詳細な理解を目指す。

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：1900000円 （ 直接経費：1900000円 ）

キンメモドキから発光活性を指標にルシフェラーゼを精製し、単離した。RNAseqとMS/MSにより、タンパク質の全長配列を決定し、同定した。その後、リコンビナントルシフェラーゼを抗原とし、抗体を作成し、天然型のルシフェラーゼを結合したカラムを用いて、アフィニティー精製を行なった。その結果、質の高い抗ルシフェラーゼ抗体が得られた。また、キンメモドキの新たな供給経路を確立した。本年度は、これらの材料を元に、ウェスタンブロットと免疫組織化学により、キンメモドキにおける同定したルシフェラーゼの局在が発光器官にのみあることを確認できた。現在、組織の微細構造を確認中であり、並行して論文化を進めている。
また、発光の進化を議論するために、同じくウミホタルルシフェリンを基質とする発光魚についてもサンプルを集めている。本年度は、スズキ目であるが異なる科のツマグロイシモチ、ガマアンコウ目のイサリビガマアンコウを入手できた。ツマグロイシモチは高知で採取され、また、イサリビガマアンコウはアメリカ合衆国のカリフォルニアで採取された。ツマグロイシモチの系統分類的位置付けは、まだはっきりしていないので、発光の進化を議論する上で、今後、分類学者との共同研究が必要になる。
これらの材料に対して、現在、キンメモドキのルシフェラーゼと相同性があるかを調べるため、同様に、ウェスタンブロットと免疫組織化学による検出を進めている。今後、反応が出た場合、プルダウンからのMS/MS解析により、タンパク質の同定を進め、配列から、進化的な考察を深めたい。