国名：日本国

国名： 日本国

備考： 5年一貫制博士課程 名古屋大学への転入に伴い退学

国名： 日本国

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：46060円 （ 直接経費：46060円 ）

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：320000円 （ 直接経費：320000円 ）

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：39580円 （ 直接経費：39580円 ）

担当区分：研究分担者  資金種別：競争的資金

配分額：800000円 （ 直接経費：800000円 ）

担当区分：研究分担者 

配分額：136000円 （ 直接経費：136000円 ）

担当区分：研究代表者 

配分額：9360000円 （ 直接経費：7200000円 、 間接経費：2160000円 ）

本研究は、「生殖細胞の性」という明確な形質に着目して生殖ライフスパンの動的な性質に迫る。そのために、成体期以降のfoxl3変異体において観察される精子形成から卵形成への性転換がどのような階層性（全身・器官・細胞）で制御されているのかを解析するとともに、生殖細胞の性転換をもたらす細胞内分子機構および体細胞からのシグナル伝達経路をRNA-seq解析により探求する。これらの研究により、生殖ライフスパンを「生殖細胞の性の恒常性」という新たな視点で捉えることが目的である。

担当区分：研究分担者 

減数分裂では、特異的な染色体構造のダイナミックな動的変化とそれに伴う相同組換えの一連のプロセスが時間軸に沿って秩序立って起こる。その全体像を理解するためには、動的な変化の理解が不可欠であるが、脊椎動物ではまだ適当な実験系はない。本研究では、我々の精子形成培養系、器官培養系、遺伝子ノックイン技術と、Elkouby 博士の卵巣イメージング法を統合して、減数分裂特異的染色体構造の動的な変化を時間軸に沿ってモニターできる新規ライブイメージング法を確立する。
減数分裂では、特異的な染色体構造のダイナミックな動的変化とそれに伴う相同組換えの一連のプロセスが時間軸に沿って秩序立って起こる。その全体像を理解するためには、動的な変化の理解が不可欠であるが、脊椎動物ではまだ適当な実験系はない。本研究では、ゼブラフィッシュにおける減数分裂全過程をカバーする精子形成培養系、メダカにおける卵巣と精巣の組織培養系および遺伝子ノックイン技術と、ゼブラフィッシュにおける卵巣イメージング法を統合して、減数分裂特異的染色体構造の動的な変化を絶対時間軸に沿ってモニターできる新規ライブイメージング法を確立することを目的とする。
減数分裂期減数分裂期の染色体は特徴的な軸-ループ構造をとり、組換えの進行に伴って、相同染色体を物理的に繋ぐシナプシスを生む。そして、この構造を足場として一連の組換えタンパク質が秩序立って機能する。これらの染色体構造、シナプシス形成と組換えタンパク質群の挙動をモニターするために、個々のタンパク質の蛍光標識技術と培養系による高解像度イメージング技術が不可欠である。昨年度までに、ゼブラフィッシュではトランスジェニック技術、メダカでは生殖細胞培養法の改良を行い、精母細胞の染色体動体をイメージングできることを確認した。これを踏まえ、本年度は、sycp3-egfpトランスジェニックメダカを用いて卵巣と精巣の初代培養によるライブイメージング解析を行い、減数分裂期の各ステージにおける染色体動態を定量的に解析したところ、ザイゴテン期からパキテン期にかけて急速な染色体回転運動がおこり、その回転運動の速度には雌雄差があることが認められた。
2021年度に確立した生殖細胞の初代培養系を用いて、野生型メダカ卵母細胞および精母細胞のライブイメージングをおこなった。初めに、培養条件下で観察される細胞の第一減数分裂前期におけるサブステージ（レプトテン〜ザイゴテン初期、ザイゴテン後期、パキテン初期、パキテン後期）を、免疫染色（SYCP1/SYCP3/DAPI）により同定した。次に、sycp3-egfpトランスジェニックメダカを用いて、SYCP3-EGFPおよびKakshineのシグナルを用いて各サブステージのタイムラプス画像を取得し、染色体運動をトラッキングした（Fiji, TrackMateプラグインを使用）。その結果、パキテン期の染色体が急速な回転運動を示すことが明らかになった。またこの回転運動の速度には雌雄差がみとめられた。
ゼブラフィッシュでは、昨年度、Hoechst 33342で処理したゼブラフィッシュ培養精母細胞の染色体イメージング画像をDeltaVision Ultraで得られることがわかったため、本年度はヒストンをGFP標識したh2a:H2A-GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを入手するとともに、テロメアの挙動をモニターできるsycp1:terf1-mNeonGreen系統の作製を進めた。また、これまでに得られたterb2ノックアウトゼブラフィッシュでは、染色体の核膜結合や染色体ブーケ構造の形成が異常となることを明らかにした。さらに、国際共同研究者のThe Hebrew University of JerusalemのElkouby博士へ訪問し、ライブイメージング設備を確認して、今後の具体的な計画を策定した。Elkouby研究室で作製したterb1ノックアウトゼブラフィッシュとterb2ノックアウトを交配させて、二重変異体の作製を進めている段階である。
メダカではザイゴテン期からパキテン期にかけて急速な染色体回転運動が生じるのと同時期に、核周辺の微小管ネットワークが再配向され、染色体ブーケ構造が解体されることが分かりつつある。これらの観察結果をもとに、2023年度は減数分裂の進行に伴う回転運動の制御機構や、回転運動の雌雄差をもたらす遺伝的カスケードを明らかにしたい。そのために、sycp3-egfpトランスジェニックメダカと複数の変異体系統（foxl3, rec8a, rec8b, terb1）を交配し、ライブイメージングに向けた準備を進める。ゼブラフィッシュではh2a:H2A-GFP系統や現在構築中のsycp1:terf1-mNeonGreen系統と、従来の固定標本により表現型が詳しく解析されている減数分裂変異体sycp1, sycp2と交配してイメージングを進め、絶対時間軸における減数第一分裂前期のプロセスを正確に把握するとともに、複数の変異体（mcmdc2, terb1, terb2, terb1/2）と交配して、ライブイメージングによる表現型解析の準備を進める。

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担当区分：研究代表者 

配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

生殖細胞が卵になるか精子になるかの運命決定は有性生殖を行う生物にとって極めて重要である。申請者のメダカを用いた研究から、ユビキチンリガーゼFBXO47が卵形成へのコミットメントに重要であり、その過程では卵形成経路と精子形成経路がせめぎ合っていることが示された。この性的拮抗関係においてFBXO47がメス性を確立していく仕組みを明らかするために、質量分析法を用いてFBXO47のユビキチン化基質を同定する。これと同時に、FBXO47のノックダウンおよび卵巣ライブイメージングの系を確立し、卵形成コミットメントに伴う細胞形態や染色体動態の変化を明らかにする。
生殖細胞が卵あるいは精子に分化する過程では、卵形成経路と精子形成経路が拮抗的に働くことで分化運命を決定していると考えられる。本研究は、この性的拮抗関係において、ユビキチン化因子FBXO47がメス性を確立していく仕組みを明らかにすることを目的としている。
これまでにfbxo47変異体メダカの生殖細胞では染色体が異常な凝縮を示し、生殖細胞の性的運命がメスからオスに転換することが明らかになっていた（Kikuchi et al., 2020, PNAS）。2022年度は、卵巣の初代培養系、ライブイメージング系、さらにAIDノックダウン系を統合して、FBXO47が染色体動態を制御している可能性に迫った。
初代培養系では、コラゲナーゼにより酵素的に乖離した生殖腺をガラスボトムディッシュに播き、培養２―３日目にディッシュ底面に固着した生殖細胞をスピニングディスク共焦点顕微鏡でライブイメージング観察した。DNAはSiR-DNA核染色試薬で、減数分裂期染色体はsycp3-egfp遺伝子をゲノムに導入することで可視化した。さらに、ライブイメージング画像から生殖細胞の核内動態を定量的に解析する方法を確立した。
AIDノックダウン系では、生殖細胞でオーキシン依存性ユビキチンリガーゼTIR1を発現するolvasp-AtTIR1トランスジェニック（Tg）系統を作製し、AIDタンパク質のオーキシン依存的分解効率を調べた。Tgメダカ胚を用いた実験から、生体ではオーキシンの浸透率が低く、高濃度のオーキシンに暴露するか、あるいはオーキシンを直接体内に注入するなどの工夫が必要であることが明らかになった。
ライブイメージング系によるfbxo47変異体の表現型解析に向けた準備は順調に進んでいる。2022年度は、sycp3-egfpトランスジェニックメダカを用いた減数分裂期染色体の動態解析が完了した。これにより、定量的解析方法の確立と野生型の雌雄生殖細胞における核内動態に関する基盤的データが揃った。
一方、FLAG抗体によるFBXO47の免疫沈降計画は想定外の事象により停滞している。2021年度には、fbxo47-3xFlagノックインメダカ系統を作出した。しかしながら予想に反して、ノックインアレルをホモに持つ個体はfbxo47変異体と同じ表現型を呈することが新たに判明した。いくつかの実験から、fbxo47-3xFlagアレルからの転写は正常に行われるが、mRNAからの翻訳が阻害されていることが示された。同様の現象は、独立して作出した複数のノックイン系統で認められており、生殖系列において外来のDNA配列をもつmRNAが何らかの仕組みで検知され、翻訳抑制機構が働いたものと考えられる。このためノックイン技術をメダカ生殖系列に適用することが現状困難と判断し、現在はFBXO47抗体による免疫沈降を行うために抗体作製に取り組んでいる。
FBXO47の免疫沈降計画については、FBXO47抗体の作製と特異性の検定を引き続きおこない、抗体が得られ次第免疫沈降を進める。当初の計画では、免疫沈降にfbxo47-3xFlagノックイン系統の卵巣を用いる予定であったが、有用な系統の作出に成功しなかったため計画を変更する。免疫沈降では野生型からタンパク質を抽出し、FBXO47抗体を用いて免疫沈降およびWesternblottingによるFBXO47の検出をおこなう。WBでFBXO47が検出された野生型サンプルを質量分析にまわす。ネガティブコントロールとしてfbxo47変異体の卵巣を用いる。
2022年度に観察した野生型での核内染色体動態をベースに、fbxo47変異体で同様のイメージング解析をおこない、野生型と比較して染色体動態におけるfbxo47の寄与を明らかにする。sycp3-egfp; fbxo47変異体卵巣を用いてライブイメージングを行い、染色体動態を野生型データと合わせて比較定量する。
AIDノックダウン系については、トランスジェニック胚を用いたオーキシン投与条件の検討を続ける。現在オーキシン濃度を50 uMまであげてもノックダウンの効果が得られていないため、100 uMオーキシンへの暴露と、胚体内へのオーキシンインジェクションを試みる。

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担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：2860000円 （ 直接経費：2200000円 、 間接経費：660000円 ）

生殖細胞の性決定（卵になるか精子になるかの運命決定）のスイッチ因子としてメダカで同定された転写因子FOXL3は、その下流でゲノム高次構造の性的二型を構築し、性特異的な遺伝子発現を制御している可能性が示唆されている。本研究では、免疫沈降-質量分析法を用いてFOXL3の共因子を網羅的に探索し、FOXL3が生殖細胞の性を司る分子メカニズムを解明することを目的としている。
FOXL3が直接発現を誘導する因子（FBXO47、REC8A）の変異体を作出し、その表現型を調べた。fbxo47変異体はメスのみが不稔となり、卵巣内には卵胞が欠失していた。fbxo47変異体の染色体は末端部がつながったリング状の異常形態を呈していた他、生殖細胞の精子形成への運命転換が認められた。rec8a変異体も雌性不稔となり減数分裂の進行に異常が認められた。これらの結果から、FOXL3の下で生殖細胞のメス化イベント（卵胞形成、精子形成抑制、減数分裂）を開始させる分子経路が明らかになった。
REC8AとFBXO47はそれぞれ染色体の高次構造とタンパク質分解に関わる因子であり、これらの事象と生殖細胞の性決定との関連が本研究で初めて示された。今後REC8AとFBXO47の機能を詳細に調べることで、生殖細胞の性を決める仕組みと卵を作り出す仕組みが分子レベルでより詳細に明らかになると考えられる。
そして卵や精子への経路を決める仕組みが明らかになれば、畜産・水産業において家畜や養殖魚の繁殖効率上昇や、生殖医療技術の改善につながると期待される。

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担当区分：研究代表者 

生殖細胞が「精子になるか卵になるか」の運命決定(生殖細胞の性決定)は、有性生殖を行なう生物にとって根本的な問題である。これまで生殖細胞の性は、生殖細胞を取り囲む体細胞の性によって決まると考えられてきた。しかしながら、実際に生殖細胞内で働く分子機構は、脊椎動物では全く明らかになっていない。
最近我々の研究室では、「生殖細胞自律的な性決定因子」foxl3を同定することに成功した。foxl3の機能を欠損させたメダカ(以下、foxl3-/-)では、遺伝的メス個体の卵巣内に受精可能な精子が作られる。さらに、foxl3-/-の生殖細胞を野生型(以下、WT)個体の卵巣に移植すると、宿主(体細胞)の性に関わらず機能的な精子が形成される。これらのことは、foxl3がメスの生殖細胞内で精子形成の開始を抑制していることを示している。本研究では、転写因子foxl3が制御するターゲット遺伝子の同定を通じて、生殖細胞の自律的な性決定機構を解明することを目的としている。
平成29年度は、前年度に行った網羅的発現解析で同定されたfoxl3下流変動遺伝子群のスクリーニングに加え、抗FOXL3抗体を用いたChIP-qPCR解析を行い、FOXL3の直接のターゲット遺伝子を同定することに成功した。現在はFOXL3ターゲット遺伝子の変異体作成および表現型解析を進めている。
上記解析と並行して、iDamIDseq法によるFOXL3結合モチーフの決定をおこなった。その結果、FOXL3結合モチーフはForkhead familyタンパク質のgeneral consensus elementと類似していることが明らかとなった。従ってFOXL3は、ターゲット特異性を決めるために、補因子と相互作用していると考えられる。

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科目区分：学部専門科目  国名：日本国

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