KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research) -
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Grant number：22K06141 2022.4 - 2025.3
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
小原 圭介
Authorship：Principal investigator
Grant amount：\4160000 （ Direct Cost: \3200000 、 Indirect Cost：\960000 ）
細胞膜の脂質二重層では内外層で脂質組成や役割が大きく異なる。その様な「脂質非対称」は細胞の生存に必須である。申請者は、脂質非対称の状態をモニターするセンサータンパク質Rim21を出芽酵母で同定した。本研究では、Rim21が脂質非対称の状態をモニターする分子機構の解明を行う。また、申請者はRim21を利用して、生きた細胞で脂質非対称の状態をモニターできる脂質非対称バイオセンサーの開発も行っており、本研究で有用な知見が得られる。本研究の推進により、脂質とタンパク質の相互作用に関する新たなパラダイムが提供できるほか、真菌感染症の予防や治療に寄与する知見が得られると考えられる。
細胞膜の脂質二重層では、内外層間で脂質分子が不均一に分布している。この様な「脂質非対称」は真核生物に共通の性質であり、この維持や調節が大きく破綻すると細胞一つとして生存できない。研究代表者は、過去に脂質非対称の状態変化を感知して適応反応を引き起こす脂質非対称センサータンパク質Rim21を出芽酵母で同定している。本研究では、Rim21が脂質非対称変化を感知し、下流因子にシグナルを出力する分子機構の解明を試みた。
今年度は、脂質非対称センサーモチーフを内包するRim21のC末端細胞質領域（Rim21C）の組換えタンパク質と脂質との相互作用を調べた。その結果、Rim21Cはホスファチジルセリンやホスファチジン酸などの負電荷を有する脂質に親和性を示し、それらの脂質の脱プロトン化を促す効果があるホスファチジルエタノールアミンがその親和性を高めることを見出した。
また、Rim21が発する脂質非対称シグナル伝達にはユビキチンリガーゼであるRsp5によるユビキチン化が必須である。本研究では、そのユビキチン化に関わるRim21の領域やユビキチン化部位などを調査した。その結果、Rim21C内のPxxYモチーフが脂質非対称シグナル伝達に必要であることが明らかになった。PxxYモチーフはRsp5がユビキチン化のターゲットを認識して結合する際にしばしば用いられるモチーフである。Rsp5のターゲットの少なくとも１つがRim21である可能性を示す結果である。一方、Rsp5が脂質非対称シグナル伝達を媒介するのに必要な領域についても調査を開始した。
Rim21Cと脂質との相互作用の解析には、RIm21Cの組換えタンパク質が必要である。しかし、大腸菌を用いたタンパク質発現系では、Rim21C組換えタンパク質はほとんど発現せず、十分な量が確保できなかった。そこで、様々なタンパク質発現系を試し、最終的にコムギ胚芽抽出液を用いたin vitro転写・翻訳系により、ある程度の量を精製することが出来た。しかし、大規模な実験にはまだ十分ではない。この点がネックになり、Rim21Cと脂質との相互作用の解析には遅れが生じている。
一方、Rim21が下流の夫因子にシグナルを出力する仕組みに関しては、Rim21内の重要なモチーフを新たに見出すことが出来た。また、ユビキチン化を担うRsp5のターゲット認識部位の調査も開始した。Rsp5は機能を失うと細胞が致死になる必須タンパク質であるため、生存に必要な機能を保ちながら、脂質非対称シグナルのみを停止することが出来る点変異体が必要であった。その様な株の構築に苦労したが進展を見た。
総合すると、前進した部分もあるものの停滞している部分もあり、やや遅れているとの判断に至った。
引き続き、Rim21Cと脂質の相互作用の解析および下流因子へのシグナル出力機構の解析を行う。
前者については、当面はコムギ胚芽抽出液を用いたin vitro転写・翻訳系を用いてRim21C組換えタンパク質の精製を行いながら、並行してより高収量で精製できるシステムを探索する。十分量の組換えタンパク質を調整できたら、脂質オーバーレイアッセイや人工膜小胞リポソームを用いたpull-dpwnアッセイなどで、脂質との相互作用を調査する。必要に応じて、Rim21C部分に変異を導入した変異組換えタンパク質も精製し、同様にアッセイを行うことで、脂質との相互作用に関わるアミノ酸残基を明らかにしていく。
下流因子へのシグナル出力機構に関しては、今年度に明らかにしたRim21内の重要なモチーフであるPxxYモチーフに変異を導入した株を用いて、シグナル伝達のどの素過程が停止しているかを調べる。これにより、PxxYモチーフが機能する素過程を明らかにする。その他、Rsp5によるユビキチン化のターゲットタンパク質やユビキチン化部位の探索、Rsp5がターゲットを認識する際に用いるドメインの解明などを行う。 -
Sensing mechanism and signal output of plasma membrane lipid asymmetry
Grant number：19K06561 2019.4 - 2023.3
Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Obara Keisuke
Authorship：Principal investigator
Grant amount：\4420000 （ Direct Cost: \3400000 、 Indirect Cost：\1020000 ）
We investigated into the mechanism of lipid asymmetry sensing by the sensor protein Rim21 and how activated Rim21 evokes signal transduction pathway. As a result, we suggested that some charged amino acid residues within and near the "sensor motif" which is located in the C-terminal cytosolic region of Rim21 (Rim21C) play pivotal roles in interaction between the plasma membrane inner leaflet and Rim21C. This is a great progress that may open the door for elucidation of molecular mechanism underlying lipid asymmetry sensing.
We also found that alterations in some physicochemical variants outside the cell, e.g. pH and salt concentration, may affect the state of lipid asymmetry. Of them at least pH elevation and high salt stress, was found to be sensed by Rim21 through alterations in lipid asymmetry. This finding deserves attention in that it sheds light on a novel aspect of the plasma membrane as a sensor structure for physicochemical variants. -
Development of a lipid asymmetry biosensor that dramatically facilitates studies on biomembranes
Grant number：18K19292 2018.6 - 2020.3
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Kamura Takumi
Authorship：Coinvestigator(s)
In this study, we tried to develop a biosensor that can report the state of lipid asymmetry in the plasma membrane. For this purpose, we focused on and utilized a lipid asymmetry sensor protein Rim21 which we previously identified in yeast. As a result, we developed a prototype of lipid asymmetry biosensor that can visualize alterations in lipid asymmetry in living yeast cells. In addition, we conducted a systematic mutagenesis approach of the prototype biosensor, and succeeded in developing a series of improved biosensors with higher S/N ratio.
Using these biosensors, we monitored the state of lipid asymmetry in yeast cells exposed to environmental stresses. Interestingly, the state of lipid symmetry seemed to be altered under alkaline and salt stresses. Cells deleted for RIM21 were hypersensitive to alkaline and salt stresses, suggesting that these environmental stresses are sensed by Rim21 through alterations in the state of lipid asymmetry in the plasma membrane. -
Elucidation of sensing mechanism of lipid asymmetry and establishment of bases for its application
Grant number：16K07288 2016.4 - 2020.3
Obara Keisuke
Authorship：Principal investigator
Grant amount：\4940000 （ Direct Cost: \3800000 、 Indirect Cost：\1140000 ）
In this study, we focused on Rim21, the sensor protein for altered lipid asymmetry in the plasma membrane. We suggested that Rim21 senses alterations in lipid asymmetry through interaction between lipid asymmetry sensor motifs in Rim21 and acidic lipids in the plasma membrane. We also elucidated the function of N-glycosylation of Rim21.
A biosensor that can report the state of lipid asymmetry in living yeast cells was developed in this study. Moreover, we succeeded in improving the S/N ratio of this prototype biosensor by mutagenesis approach.
Rim21 invokes a signal transduction pathway called the Rim101 pathway, and this pathway is a good potential drug target. We revealed that activation of this pathway is regulated by antagonistic action of ubiquitination and deubiquitination. In addition, we elucidated the mechanism and the biological significance of attenuation of the Rim101 pathway. -
乱れた脂質非対称の感知および修繕機構
Grant number：25440038 2013.4 - 2016.3
日本学術振興会 基盤研究(C)
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\5330000 （ Direct Cost: \4100000 、 Indirect Cost：\1230000 ）
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脂質非対称を感知して伝達する分子機構の解明
Grant number：25650059 2013.4 - 2015.3
挑戦的萌芽研究
Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) Grant type：Competitive
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極長鎖脂肪酸産生の分子メカニズムと病態，生理機能の解明
Grant number：23370057 2011.4 - 2014.3
基盤研究(B)
Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) Grant type：Competitive
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脂質非対称センシングの分子機構と細胞応答
Grant number：23770135 2011.4 - 2013.3
日本学術振興会 若手研究(B)
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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脂質非対称を感知するセンサーと細胞内シグナルの分子機構の解明
Grant number：23657120 2011.4 - 2013.3
挑戦的萌芽研究
Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) Grant type：Competitive
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脂質分子から迫るオートファゴソーム形成機構の研究
Grant number：21770129 2009.4 - 2011.3
日本学術振興会 若手研究(B)
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\4550000 （ Direct Cost: \3500000 、 Indirect Cost：\1050000 ）
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Phs1ファミリーによるホスファチジルイノシトールの細胞内輸送機構の解明
Grant number：20687008 2008.4 - 2011.3
若手研究(A)
Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) Grant type：Competitive