担当区分：研究分担者 

本研究はオートファジー隔離膜の初期構造の同定を目的とした。アミノ酸飢餓誘導によるオートファジーの解析は他グループから発表されたため、対象をマイトファジーに絞った。その結果、鉄欠乏誘導性マイトファジーにおいて、ミトコンドリア表面における隔離膜伸長がミトコンドリアの部分隔離に重要であること、および近傍の小胞体が前駆体となる可能性を示すことができた。また、隔離膜の構造を走査型電子顕微鏡で観察することに成功し、次の研究に繋げることができた。さらに、創傷治癒過程の線維芽細胞および癌カヘキシアで見られる萎縮筋線維において、オートファジー・リソソーム分解系が重要な働きを担うことを示唆した。

担当区分：研究分担者 

オートファジー隔離膜の近傍に見出された新規細管構造としてisolation membrane-associated tubule (IMAT)を見出し、その詳細な解析を行った。電子線トモグラフ法を用いた三次元立体構築によりIMATが小胞体と隔離膜に内腔を通じて連続していること、オメガソームの本体であること、小胞体における隔離膜生成の初期過程に関連することを明らかにした。また、電子顕微鏡でIMATを検出するためにオスミウム酸を用いた新規固定法を開発した。小胞体で始まる隔離膜生成の最も初期の形態変化は未だ捉えられておらず、ここに関与する分子機構も含め、本研究がこれら疑問に答える糸口になる。

担当区分：研究代表者  資金種別：競争的資金

配分額：5590000円 （ 直接経費：4300000円 、 間接経費：1290000円 ）

エンドソーム、ライソゾームなどのポストゴルジの小器官で機能する蛋白質はトランスゴルジ網（TGN）において目的の小器官への経路へと選別される。この仕分けの過程は細胞機能特異的なポストゴルジのコンパートメント、すなわちライソゾーム関連オルガネラ（LRO）を形成する時にも必須な役割を演じている。本研究においてはショウジョウバエモデルを用い、ゴルジ体に局在するクラスリンアダプター分子群がLRO及びライソゾームの生合成に重要な役割を演じていることを明らかにし、同時にショウジョウバエがヒトライソゾーム蓄積症候群の良いモデル系となりうることが示唆された。

本研究はショウジョウバエの培養細胞系を用いてクラスリン被覆小胞の形成とクラスリン依存的な小胞輸送の素過程を分子レベルで明らかにし、細胞構成要素の発現制御の分子機序に迫ることを目的としている。(1) これまでに動物細胞のクラスリンアダプターGGAs,AP-1複合体のショウジョウバエホモログであるdGGA及びdAP-1複合体及び関連因子のクローニングと性状解析を行い、クラスリン被覆小胞の形成に於いてショウジョウバエが哺乳動物及び出芽酵母と非常によく似たメカニズムを有していることを示し、論文で報告した、また、(2) S2培養細胞系を用いて、リソソームに局在する蛋白質分解酵素の選別受容体Lerpの輸送を生化学的及び細胞生物学的にモニターするアッセイ系を確立し、クラスリンアダプター分子群及びその制御因子であるARF small GTPaseファミリーの分子群が実際にLerpの輸送に関与していることを示すことに成功した。更に、(3) ゴルジ体から形成されるdGGAを含む膜小胞がLerpを含むことを、GFP-dGGA及びmCherry-Lerpを用いた生細胞内観察により示した。(4) 関連因子の生化学的な性状解析を行った後,野生型S2細胞あるいは遺伝子ノックダウン株由来の単離膜及び細胞質フラクション、精製リコンビナント蛋白質を用いたクラスリンの細胞質から膜へのリクルートを試験管内で再構成することに成功した。

細胞内における膜貫通型蛋白質のオルガネラ間の輸送は主に膜小胞を介して行われる。GGA, AP-1等のクラスリンアダプターと呼ばれる分子群は、膜蛋白質の選別輸送に必要なクラスリン被覆小胞形成において必須な役割を担っているが、その分子機能および調節機構の詳細は不明な点が多い。本研究に於いてはショウジョウバエの培養細胞系においてこれらの分子群の性状解析を行い、ショウジョウバエ細胞においても哺乳動物細胞と同様なメカニズムでクラスリンアダプターが膜蛋白質輸送において機能していることが示された。

BACEはAβの産生に関与する重要なアスパラギン酸プロテアーゼ(β-secretase)であり、細胞内でのβ-secretase活性の発現部位やその局在化機構を明らかにすることはアルツハイマー病の発症機序の解明のみならず治療においても重要な意義を持つ。BACEはトランスゴルジ網(TGN)で選別され,細胞膜まで小胞輸送される。BACEの局在化には24残基からなる細胞質ドメインが必須である。これまでの研究から、BACEの細胞質ドメインにはGGA(Golgi-localizng,gamma-adaptin ear homology domain,ARF-interacting)と結合する酸性クラスターdileucineシグナルがあり、BACEがTGNとその近傍に局在することに関与し、同シグナル内のSer498のリン酸化がGGAとの結合を制御していることも示唆されてきた。今回、我々は、BACEの細胞質ドメインとGGA1のVHSドメインとの結合様式を調べた。HeLa細胞で、BACEとGGA1との共局在を調べたところ、核周囲のゴルジ領域とその近傍の点状構造物で共存することが分かった。Brefeldin Aで同細胞を処理すると、BACE陽性のチューブ状構造物がTGNから進展した。すなわち、BACEの輸送はARF依存性に調節されていることを示唆している。次に、BACEの細胞質ドメインペプチドとGGA1のVHSドメインをBIACOREで解析したところ、結合定数(Kd)が0.83μMであることが分かった。また、Ser498のリン酸化によって両者の結合力が2倍以上(Kd=0.32μM)に上昇することも分かった。さらに、両者の結合様式をX線結晶構造解析(解像度1.9Å)により調べた結果、両者の結合は、リソソーム酵素をTGNからリソソームへと選別輸送するMPRとGGAとの結合様式と類似していた。その解析から、BACE-tailのSer残基とLys残基は溶媒面に向くことが分かり、BACEの細胞質ドメインのSer残基がリン酸化されると、Lys残基やペプチド骨格が水素結合の数を増加すること、また、GGA1のVHSドメインとの静電気結合を増強することにより、両者の親和性が不可逆的に増加する可能性が示された。

APPのプロセシングの分子機構及びその調節機構を明らかにする目的でβ-セクレターゼ(BACE)の性状解析を行ってきた。培養細胞に発現させたBACEはTGN、エンドソーム、細胞膜に局在し、これらのポストゴルジコンパートメントへのBACEの局在化には24アミノ酸からなる細胞質ドメイン(BACE-Tail)が不可欠であることが知られている。BACEの細胞内局在化機構を明らかにする目的でこれらの領域と結合する蛋白質を探索した結果、phospholipid scramblase1(PLSCR1)を同定し、両蛋白質の相互作用について詳細に検討した結果、PLSCR1との結合にはBACE-tail内のジロイシン配列(LL)が必須である事が明らかとなった。細胞生物学的手法、及び細胞内におけるコレステロール輸送の阻害剤を用いた解析により、PLSCR1がBACEと共通の輸送経路を通って細胞内で輸送されている事、更に両蛋白質が細胞内でラフトと呼ばれる膜脂質の微小ドメインに存在し、細胞内で蛋白質複合体を形成している事を明らかにした。近年、試験管内結合実験により、BACE-tailがアダプター蛋白の一種であるGGA1及びGGA2と直接的に結合する事が報告された。GGAはクラスリン被覆小胞の形成に関与するsmall GTPaseであるARF(ADP-ribosylation factor)依存的にTGNからの蛋白質輸送に関わる事が知られている。我々はBACE-tail及びGGA1が直接的に結合するだけでなく、その親和性がBACE-tailのセリン残基のリン酸化により変化することを見い出した。BACE-tailのリン酸化はBACEの細胞内輸送の調節に関わっている事が示唆されており、BACEの細胞内輸送の調節機構としてBACE-tailのリン酸化が重要な役割を担っている可能性が示唆された。

我々はこれまでにAPPのプロセシングの分子機構及びその調節機構を明らかにする目的でβ-セクレターゼ(BACE)の性状解析を行ってきた。培養細胞に発現させたBACEはTGN、エンドソーム、細胞膜に局在し、これらのポストゴルジコンパートメントへのBACEの局在化には24アミノ酸からなる細胞質ドメイン(BACE-Tail)が不可欠であることが知られている。BACEの細胞内局在化機構を明らかにする目的でこれらの領域と結合する蛋白質を探索した結果、phospholipid scramblase1(PLSCR1)を同定し、両蛋白質の相互作用について詳細に検討した結果、PLSCR1との結合にはBACE-tail内のジロイシン配列(LL)が必須である事が明らかとなった。細胞内におけるコレステロール輪送の阻害剤を用いた解析により、PLSCR1がBACEと共通の輸送経路を通って細胞内で輸送されている事、更に両蛋白質が細胞内でラフトと呼ばれる膜脂質の微小ドメインに存在し、細胞内で蛋白質複合体を形成している事を明らかにした。近年、試験管内結合実験により、BACE-tailがアダプター蛋白の一種であるGGA1及びGGA2と直接的に結合する事が報告された。GGAはクラスリン被覆小胞の形成に関与するsmall GTPaseであるARF(ADP-ribosylation factor)依存的にTGNからの蛋白質輸送に関わる事が知られている。我々はBACE-tail及びGGA1が直接的に結合するだけでなく、その親和性がBACE-tailのセリン残基のリン酸化により変化することを見い出した。BACE-tailのリン酸化はBACEの細胞内輸送の調節に関わっている事が示唆されており、BACEの細胞内輸送の調節機構としてBACE-tailのリン酸化が重要な役割を担っている可能性が示唆された。

本研究はアルツハイマー病におけるAPPプロセシングに関わるBACE及びその類似蛋白質BACE2の性状解析を細胞生物学的手法を用いて行う事により、細胞内におけるβ-部位切断の起こる場所を明らかにし、さらにβ-セクレターゼ活性の調節機構を分子レベルで明らかにすることを目的としている。培養細胞に発現させたBACE及びBACE2の局在は大きく異なりBACEがTGN、エンドソーム、細胞膜に局在するのに対し、BACE2は主に小胞体に局在した。更に細胞生物学的手法を用いてこれらの分子の細胞内局在化機構を調べたところ、BACEは細胞質領域がエンドソームへの局在化に必要であるのに対し、BACE2は内腔側の領域が小胞体への局在化に必須である事が明かとなった。BACEの細胞内局在化に関わる因子を同定するためにツーハイブリッド法を用いた結合蛋白質の探索を試みた結果、phospholipid scramblase(PLSCR1)を同定した。さらにリコンビナント蛋白質を用いた試験管内結合実験及び共免疫沈降実験により、PLSCR1がBACEの細胞内局在化シグナルを有する細胞質領域に直接結合し細胞内においても蛋白質複合体を形成している事が明かとなった。これらの蛋白質は形質膜の微小ドメインである脂質ラフトに局在し、PLSCR1との結合ドメインを欠失したBACE変異体が脂質ラフトへの局在化にも欠損を示すことから、PLSCR1はBACEの脂質ラフトへの導入に関与しているのかもしれない。

資金種別：競争的資金

細胞内蛋白質輸送，特にゴルジ体での蛋白質の選別輸送に関わる分子機構とその調節に関わるメカニズムを研究している。

資金種別：競争的資金

リソソームへの蛋白質輸送の分子メカニズムとその生理的意義を、ショウジョウバエを用いて細胞、個体レベルで解析する。

資金種別：競争的資金

We are approaching the molecular mechanisms and physiological roles of lysosomal protein trafficking in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

資金種別：競争的資金

We are focusing on the molecular mechanisms on the protein sorting/trafficking at the TGN.