科研費 - 石井 晃
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大麻中微量活性物質の有効性及び毒性評価のための多面的プラットフォームの構築
研究課題/研究課題番号：23K18387 2023年6月 - 2025年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
石井 晃, 名取 雄人
担当区分：研究代表者
配分額：6110000円 （ 直接経費：4700000円 、 間接経費：1410000円 ）
大麻は、広く使用されている乱用薬物であるが、近年、大麻関連物質が慢性疼痛の緩和や難治性てんかんに有効である等の報告がなされ、医療応用が今後広がると考えられる。今回の計画は以下の通り。高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法を用いた一斉分析を開発し、大麻に含まれる微量活性成分の抽出と同定を行う。次に、培養細胞を用いた細胞生存率の評価やメタボロミクス解析などで、毒性が低く有用な生理活性を有する可能性のある化合物を選択する。さらに、動物実験により、異常行動の惹起が少なく、有用性が期待できる化合物を個体レベルで評価し、最終的に毒性評価、薬理作用及び有効性評価の多面的プラットフォームを構築する。
大麻は、日本で広く使用される乱用薬物でゲートウェイドラッグでもある一方で、その医療応用が脚光を浴びている。医療目的としては、制吐剤、AIDSによる消耗状態等に対する食欲の増進、多発性硬化症における疼痛の改善、非がん性の慢性疼痛のコントロール、難治性てんかんの治療等が挙げられる。本研究では、天然の大麻からTHC等の有害成分を除いた微量活性成分を含む試料の抽出法の開発や、大麻の微量活性成分を特に生薬として抽出する。その後、抽出物の総合的評価を行うことが可能となる毒性評価や、薬理作用及び有効性評価の多面的プラットフォームの作成し、個々の微量活性成分の探索プロジェクトにつながる方法論を構築する。
まず、乾燥大麻草を液体窒素で凍結させ、マルチビーズショッカーで粉砕し、クロロフォルムで抽出後、固相抽出で不純物を精製し、DMSOで解し、次の細胞実験に使用した（これをC.S.と呼ぶ）。マウス視床下部由来GT1-7 細胞へ、終濃度10～1000 microMでC.S.を添加し、他方合成カンナビノイド HU210を終濃度 2.5～20 microM添加したものをコントロールとし、まず、細胞死と代謝への全体的影響を検討した。HU210を加えると 24時間後には 20 microM で細胞死が増加し、10 microM で全体的な代謝が減弱していた。ところが、C.S.では、24時間後の細胞死が抑制され、500 microM以上で代謝が抑制された。
次いで、メタボロミクスによる代謝経路への影響を検討したところ、HUS210とC.S.で、共通してクエン酸回路、ペントース・グルクロン酸相互変換系、アスコルビン酸・アルダル酸代謝が変動し,HU210 ではグリセロリン脂質・グリセロ脂質代謝や一部のアミノ酸代謝、C.S.ではタウリン・ヒポタウリン代謝、ピルビン酸代謝、一部のアミノ酸代謝の変動が観察された。
乾燥大麻からの抽出物による代謝物変化を、メタボロミクスを用いて検出することができ、同じレセプターに作用する合成カンナビノイドとの類似作用及び相互に異なる作用を抽出することに成功しており、今後、大麻中の微量成分の作用解析につなげていく道筋が大まかにできているため。
今後、培養細胞実験を継続し、その結果を踏まえて大麻抽出物を用いた行動解析に移る予定である。 -
マルチオミクス手法による合成カンナビノイドの毒性機序解析：心血管系を中心として
研究課題/研究課題番号：23K09762 2023年4月 - 2026年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
名取 雄人, 石井 晃, 道志 勝
担当区分：研究分担者
カンナビノイド受容体アゴニストは主にCB1 受容体やCB2 受容体に作用する一連の化合物である。その中でもTHCや合成品カンナビノイドの多くは違法薬物に指定され、乱用による死亡例も報告されている。これらの化合物は心血管障害のリスクを高めることが報告されているが、その詳細なメカニズムはいまだ不明である。そこで本研究では、培養細胞や動物実験を用いて、これらCB1受容体アゴニストが心血管障害を引き起こすメカニズムの解明を目的とする。
カンナビノイド受容体（CB受容体）アゴニストは大麻由来のΔ9- tetrahydrocannabinol (THC)等が知られている一方で、近年合成品が乱用され中毒死を含めた健康被害等が社会的な問題となっている。当研究室では合成カンナビノイドの乱用による急性中毒死亡例を経験したが、その死因のメカニズムは不詳である。これらカンナビノイド類は心血管障害の他様々な障害を惹起することが報告されてきた。以上のことから、カンナビノイド受容体アゴニストによる死因の少なくとも一部は心筋梗塞や不整脈などの急性循環器障害である可能性が考えられた。また、心臓や血管内皮細胞のような末梢組織でもCB1受容体の発現していることから、今年度は血管内皮由来の培養細胞を用いて、合成カンナビノイドおよび大麻抽出物によるメタボローム変動を調べた。
大麻からカンナビノイドを抽出した結果THC等を同定した。次に血管内皮細胞様細胞を合成カンナビノイドまたは大麻抽出物とともに3時間・24時間培養して細胞死と細胞の代謝活性について調べた。その結果大麻抽出物では細胞死に影響はなかったが、代謝活性は若干減少した。一方で合成カンナビノイドでは、いずれのタイムコースでも濃度依存的に細胞死が増加し、代謝活性は同様に減少した。次に合成カンナビノイド・大麻抽出物で細胞を培養して、メタボローム解析を行った。解析の結果PCAにおいてcontrol・合成カンナビノイド・大麻抽出物の各群が分離した。合成カンナビノイドと大麻抽出物を比較した結果、TCA cycleのような基礎的なエネルギー代謝の他、Inositol phosphate metabolism等様々な代謝経路が変動していることが分かった。以上のことから、合成カンナビノイドと大麻抽出物ではそれぞれ代謝に及ぼす影響が異なることがわかった。
本年度の結果から、大麻草から大麻カンナビノイドを抽出する方法を確立することができ、液体クロマトグラフタンデム質量分析計を用いることで、9種類の大麻カンナビノイドを同定することができた。さらに血管内皮細胞様培養細胞において、合成カンナビノイドでは高濃度では顕著な細胞毒性を示すのに対して、大麻抽出物においては細胞死を伴う毒性を示さなかった。
大麻抽出物と顕著な細胞死を示さない程度の合成カンナビノイド濃度を用いて血管内皮細胞様培養細胞の代謝変動を網羅的に調べた結果、115成分中43成分で変動し、多くの代謝経路でこれらカンナビノイドによる影響が異なることがわかった。本研究ではin vitroの系において多種類の培養細胞を共培養することでより生体内に近い環境でのアッセイ系の構築も目的としており、すでに複数の異なる起源をもつ培養細胞を入手し、培養条件の確立を行っている。さらに共培養のための培養容器も入手済みである。
今後は個々の培養細胞への合成カンナビノイド・大麻カンナビノイドが及ぼす代謝系への影響を調べた後に、共培養系を用いた解析を行う予定である。共培養系においては、合成カンナビノイド・大麻抽出物が影響を及ぼす細胞間の液性因子による相互作用を検討する。そのために、培養上清中のサイトカインのアレイによるスクリーニングを行い、変動が認められる場合には個々のELISAを用いた定量を予定している。また、プロスタグランジン類は生体機能の恒常性に大きく寄与することから、これらの解析についてもアレイ・ELISAのような免疫学的な方法と合わせて、液体クロマトグラフ質量分析計を用いた一斉分析方法の確立も検討し、免疫学的な方法との比較を行う予定である。
最終的にはマウスを用いたin vivoの実験を行い、特に持続的な合成カンナビノイド・大麻抽出物の投与が血圧や脈拍のようなバイタルサイン変動に及ぼす影響を調べるとともに行動解析も行う。また、大麻や合成カンナビノイドを代表とした危険ドラッグは酒類とともに摂取することが多いため、エタノールとの同時摂取による影響についても検討する。 -
研究課題/研究課題番号：19K22756 2019年6月 - 2024年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
石井 晃, 名取 雄人
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：6240000円 （ 直接経費：4800000円 、 間接経費：1440000円 ）
本研究においては、ペプチド質量分析に習熟した研究協力者と共に、最新の質量分析技術を駆使して、熱中症等で上昇する尿中ミオグロビン、頸部圧迫で上昇する可能性がある血液中サイログロブリン、心不全のマーカーである血液中NT-proBNPなどについて、分解したペプチドをターゲットとした同定・定量法を確立する。同時に、死後変動の再検討も行い、死後経過時間の長い死体におけるこれらタンパク及び分解ペプチドマーカーの高感度かつ正確な同定・定量を試みる。最終的には、法医鑑定に資する体液中分解ペプチドマーカーを確立する。
法医鑑定においては、病歴や生理検査等の情報が得られないため、病理組織検査や薬毒物検査のみならず、法医生化学的検査も施行される。今回、我々は、尿中ミオグロビン及び血中NT-proBNPを対象として、法医生化学的応用の可能性と限界について検討した。
尿中ミオグロビンについては、腐敗尿サンプル中では、Western blotting によってミオグロビンのバンドが検出できなかった。しかし、腐敗尿サンプルでも、アセトニトリル沈殿後に再溶解とトリプシン/リシルエンドペプチダーゼ消化を行い、感度の減弱を認めたもののペプチド分析が可能であった。その原因は腐敗尿中の夾雑物によるイオン化等の阻害が想定された。
前述したように、法医解剖に付されるご遺体は、死亡に至る情報や検査結果が得られず、死後の腐敗変性が著明であることも多いため、より正確な鑑定を行うため、病理解剖では通常施行されない検査も応用することがある。特に、法医生化学的検査は、種々の限界があるものの、場合によっては有効なものもある。本研究を進めることにより、ある種の生体中タンパクの高感度分析法が確立され、応用の限界等が明らかになれば、法医鑑定の制度が向上し、司法解剖のみならず、死因究明の解剖にも還元されるため、学術的のみならず、社会的意義は大きい。 -
高感度新規胆汁酸分析法を用いたNASH肝線維化に関わる胆汁酸種の解明
研究課題/研究課題番号：19K11653 2019年4月 - 2023年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
浅野 友美, 那須 民江, 石井 晃, 北森 一哉
担当区分：研究分担者
より高感度に胆汁酸分析が可能なnano LC/MS/MSと呼ばれる新規質量分析法を用い、NASH肝線維化の発症および重症化に関わる胆汁酸種や組成を明らかにする。高脂肪・高コレステロール（HFC）食の摂取により、NASH進展を示すモデルラットSHRSP5/Dmcrの肝線維化には、肝臓中の胆汁酸種の毒性強度や組成が強く影響する。本研究では、発症や重症化に関わる胆汁酸種や組成変化を捉えるため、SHRSP5/Dmcrに加え、HFC食摂取により肝線維化の重症度が異なる系統基ラットSHRSPおよびWKYを用い、3系統のラットの肝線維化重症度の差と胆汁酸組成の差から、肝線維化に関与する胆汁酸を明らかにする。
高脂肪・高コレステロール（HFC）食摂取により肝線維化の重症度が異なる①SHRSP5/Dmcrラット（重度線維化）、②SHRラット（軽度線維化）、③WKYラット（線維化殆どなし）の肝臓中胆汁酸の分析を実施した。
3系統ともHFC食の摂取により、グリシン抱合型胆汁酸（G-BA）の増加とタウリン抱合型胆汁酸（T-BA）の減少を示した。特に、SHRSP5/DmcrでT-BA値が低値であった。
胆汁酸抱合化能やHFC食摂取によるG-BAの合成・蓄積と、T-BA合成の低下がNASHの肝線維化に関与すると考えられた。
本研究課題では、capillary LC/MS/MSによる高分離かつ高感度な分析方法を構築し、HFC食摂取による肝線維化の重症度が異なる3系統ラットの胆汁酸プロファイリング分析を行った。
3系統を比較することで、HFC食摂取による肝臓中胆汁酸組成の変化とWKY、SHR、SHRSP5/Dmcrの亜系統化の過程における肝臓中胆汁酸組成の変化が示され、これらの組成変化が肝線維化の進展と重症化に関与していることが明らかとなった。本研究によりNASHの予防や早期診断、重症化予防のための食事法や診断方法開発の一助となる知見が得られた。 -
重水素標識標準品を用いた体液中自然毒の精密分析及び診断用マルチマーカーの探索
研究課題/研究課題番号：18H03064 2018年4月 - 2021年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
石井 晃, 高橋 秀依, 林 由美, 財津 桂, 妹尾 洋, 小川 匡之, 草野 麻衣子, 名取 雄人
担当区分：研究代表者
配分額：16380000円 （ 直接経費：12600000円 、 間接経費：3780000円 ）
本研究の目的は、薬毒物中毒において、未だ診断が困難な自然毒について、重水素標識自然毒を用いた分析を用い、より精密な同定・定量法を確立することである。今回、自然毒の分析に適した重水素標識自然毒は得られなかったものの、液体クロマトグラフ－四重極飛行時間型タンデム質量分析計を用い、56種類の自然毒を同定するスクリーニングシステムを開発し、実際の中毒事例にも応用した。また、迅速固相抽出法とQTrapによる超高感度質量分析法を組み合わせることにより、12種類の植物毒を血清中から高感度に分析する方法も開発した。この方法も実際の中毒例に応用されることが期待される。
自然毒中毒は、事故、自殺、他殺のいずれにおいても原因物質となり得るため、法医学的に重要な物質である。しかし、これら化合物は複雑な構造を有し、極めて低い濃度で作用を発現するものも多いため、ヒト試料からの同定、定量は困難であることが多い。同様に、救急医療などの分野においても、これら自然毒の診断は重要であるものの、上記の理由により診断はしばしば困難である。今回、我々は、56種類の自然毒のスクリーニングシステム及び、12種類の植物毒の迅速高感度分析法を開発した。これらの分析法は、法医学のみならず、救急医学や環境医学等、幅広い分野に応用可能であり、学術的、社会的な意義は大きい。 -
最新質量分析計による体液中危険ドラッグの検出・同定法の開発及び学際的検討 国際共著
研究課題/研究課題番号：15H02530 2015年4月 - 2018年3月
科学研究費補助金 基盤研究(A)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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非アルコール性脂肪性肝炎の新たな予防戦略：血圧と栄養管理の重要性に関する研究
研究課題/研究課題番号：15H04788 2015年4月 - 2018年3月
那須 民江
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
血圧正常（WKY）と高血圧ラット（SHRとSHRSP5/Dmcr）にHFC食を与え、NASH発症の違いを比較した。高血圧ラットには重度のNASHが観察されたが、血圧正常ラットは軽度の変化であった。高血圧動物ではHFC食摂取によりTGFβ/MAPKのシグナルの上昇がみられたが、Nrf2系のシグナルは抑制され、HO-1の発現上昇も抑えられた。
SHRラットにHFCと降圧剤を併用し、NASH進展抑制効果を観察した。降圧剤介入はHFC食によるNASHを有意に低下させた。降圧剤はHFC誘導性の肝炎や線維化に関連した分子シグナルの上昇を抑制した。NASHの予防には脂質と血圧コントロールが必要である。 -
自然毒投与ラット体内の代謝プロファイリング解析
研究課題/研究課題番号：15K08889 2015年4月 - 2018年3月
小川 匡之
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
自然毒が生体に与える影響、毒性、作用機序を明らかにすることを目的として、ラット体内の代謝プロファイリング解析に取り組んだ。当初目的とした、メタボロミクス解析とiTRAQ タンパク質発現・相対定量解析の連結評価法確立には至っていないが、自然毒投与ラットに対して、GC-MS/MS、LC-QTOF-MSを用いた分析を行い、毒性作用機序が不明な自然毒の代謝プロファイリング解析を行うための基礎データの蓄積がなされた。
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最新質量分析計による体液中危険ドラッグの検出・同定法の開発及び学際的検討
研究課題/研究課題番号：15H02530 2015年4月 - 2018年3月
科学研究費補助金
石井 晃
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：25870000円 （ 直接経費：19900000円 、 間接経費：5970000円 ）
本研究の目的は、最新の質量分析装置及び通常の質量分析計を結合し、合成カンナビノイドを含む危険ドラッグの超高感度・特異的分析法と、簡易で包括的なスクリーニング方法を開発することである。
我々は高速液体クロマトグラフ-四重極飛行時間型質量分析計(LC－QTOFMS)を用い、ヒト血漿中合成カンナビノイド及びこれら代謝物の高感度・特異的分析法を開発した。このほか、5-fluoro-ADB(5-F-ADB)とdiphenidine中毒例について、初めて血液中からの5-F-ADBの検出に成功し、代謝経路の同定も行った。現在、5-F-ADBの臓器分布の差異とカルボキシエステラーゼとの関連性を検討中である。 -
バイオマーカーとしての胆汁酸の法医学的応用
研究課題/研究課題番号：24659337 2012年4月 - 2016年3月
科学研究費補助金
担当区分：研究代表者
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新しいフーリエ変換ーリニアイオントラップ質量分析計の法医学への応用
研究課題/研究課題番号：23390183 2011年4月 - 2015年8月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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ナノスケール高速液体クロマトグラフィー/質量分析計の法医学への応用
研究課題/研究課題番号：18209025 2006年4月 - 2010年3月
科学研究費補助金 基盤研究(A)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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固相マイクロ抽出法による新規乱用薬物のスクリーニング分析
研究課題/研究課題番号：17590587 2005年4月 - 2007年3月
科学研究費補助金 基盤研究(C)
浜島 誠
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
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薬毒物の作用機序の解析に有用な新しい質量分析法
研究課題/研究課題番号：15659156 2003年4月 - 2006年3月
科学研究費補助金
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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高速液体クロマトグラフィー/レーザースプレー質量分析計の法医学への応用
研究課題/研究課題番号：14207023 2002年4月 - 2006年3月
科学研究費補助金 基盤研究(A)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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カラムスイッチング・イオンクロマトグラフィーによる無機薬毒物の迅速スクリーニング
研究課題/研究課題番号：13557037 2001年4月 - 2004年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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GC/MS/MSによるヒト体液中乱用薬物の高感度分析法の確立及びマニュアル化
研究課題/研究課題番号：12670391 2000年4月 - 2002年3月
科学研究費補助金 基盤研究(C)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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ヒト汗に含まれる薬物の連続的定量法による非侵襲ドラッグモニタリングの実現
研究課題/研究課題番号：11559008 1999年4月 - 2002年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
津田孝雄
担当区分：研究分担者
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アリル特異的MVR-PCR迅速検出法を用いた法医分子遺伝学的解析法の確立
研究課題/研究課題番号：11670411 1999年4月 - 2001年3月
科学研究費補助金 基盤研究(C)
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
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HPLC/タンデムMSによるドーピング薬物の迅速高感度検出法の確立
研究課題/研究課題番号：10770188 1998年4月 - 2000年3月
科学研究費補助金 奨励研究（A）
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
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法医学的応用のための表面電離型有機マススペクトロメータ(SIOMS)の開発
研究課題/研究課題番号：09307008 1997年4月 - 2000年3月
科学研究費補助金 基盤研究(A)
鈴木 修
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
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マイクロ固相抽出(SPME)法による体液中乱用薬物の高感度検出法
研究課題/研究課題番号：08770308 1996年4月 - 1997年3月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者
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アルコール依存症の分子機構:神経系の細胞内シグナル伝達機構へのエタノールの影響
研究課題/研究課題番号：08044264 1996年4月 - 1997年3月
科学研究費補助金 国際学術研究
鈴木 修
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
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トリカブト毒成分(アコニチン)HPLC/MSによる高感度分析
研究課題/研究課題番号：06770317 1994年4月 - 1995年3月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金