科研費 - 村井 篤嗣
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ユニークな抗体受容体によるトリ血中IgYの延命機構の解明と免疫増強への応用
研究課題/研究課題番号：23H02361 2023年4月 - 2026年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
村井 篤嗣, 水島 秀成
担当区分：研究代表者
配分額：18850000円 （ 直接経費：14500000円 、 間接経費：4350000円 ）
血中の免疫グロブリン（IgY）の代謝寿命は極めて長く、病原体の持続的排除を可能にするが、鳥類ではこの延命化の機構は全く明らかでない。本研究では、IgYとの結合能を持つユニークなホスホリパーゼA2受容体（=PLA2R）が血中のIgYを延命化する機構を明らかにし、その機能を利用して家禽のIgYレベルの増強を目指す。ニワトリやウズラを用いて、貪食細胞のマクロファージがIgYの延命化に寄与しているのか、そして、ゲノム編集によりPLA2Rを欠損するウズラ個体を作出して、血中IgYの延命化機構を明らかにするとともに、PLA2Rが免疫機能の増強に働くことを証明する。
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卵黄を取り込むトリ卵母細胞で高発現する新奇受容体のリガンド探索と生理機能の発掘
研究課題/研究課題番号：22K19244 2022年6月 - 2024年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
配分額：6370000円 （ 直接経費：4900000円 、 間接経費：1470000円 ）
鶏卵の黄身は一つの卵母細胞に大量の卵黄が集積したもので、一部の血中成分が優先的に取り込まれたものです。我々は、あらゆる動物種で同定例がない新奇なLRP2L(Low-density lipoprotein Receptor-related Protein 2-Like)受容体がニワトリの卵母細胞膜で特異的に発現することを見つけ出しました。本研究ではこのLRP2L受容体が卵黄に取り込む物質を見つけ出すことに取り組みます。マウスの卵巣でも類似の遺伝子が発現しており、卵生動物ではないマウスにおける発現特性と生殖機能との関連性を調査します。
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研究課題/研究課題番号：21H02346 2021年4月 - 2024年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
古瀬 充宏, 豊後 貴嗣, 村井 篤嗣
担当区分：研究分担者
現在、西欧諸国が提案するアニマルウェルフェアの考えを導入した飼養技術への変更が強く求められている。しかし採卵鶏に関して我が国が取り入れにくい問題は、飼育面積の拡張と飼育ケージの形状の改変である。国内生産にほぼ依存している卵の生産は、海外の基準に従うことにより、需要を賄えなくなる。ウェルフェアの目的を達成するには、ストレッサーを軽減することが重要なポイントとなる。本研究では、従来の採卵鶏の飼育環境から「負の情動の軽減」を試みる。「従来のケージ飼育した群」と「平飼い群」を比較し、その結果を基に管理技術と栄養素の強化から、「負の情動の軽減」を確認し、我が国に適した養鶏技術の構築・提案を目指す。
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表皮培養と胎児皮膚形成の特殊性に着目した分化機構と羊水成分の解明
研究課題/研究課題番号：20K20568 2020年7月 - 2023年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(開拓)
人見 清隆, 村井 篤嗣, 大蔵 聡
担当区分：研究分担者
生体の他の組織と同様に、皮膚表皮も細胞を体外で培養して再現できる。その際、未分化な細胞を、底面より培地を供給しつつ細胞の上層においては培地を極力除いた状態にする「空気暴露」が分化に必須である。この理由は不明であり、そのメカニズムを解明するため、空気暴露した細胞の中で何が起るのか、発現される遺伝子やタンパク質を明らかにする。
一方、空気に暴露されなくても羊水の中で育つ胎児は表皮が形成される。これは上の事実と矛盾し、何らかの表皮分化促進因子が羊水中にあると考えた。実際に羊水中には培養表皮細胞の分化を促進させる物質が存在することを見出したため、羊水から該当するタンパク質性因子を精製同定する。
本課題の目的は、表皮形成を細胞培養で再現する際に「空気暴露」が分化進行に必須な刺激となるメカニズムの解明と、その現象から着想した羊水からの表皮細胞分化制御因子の探索である。表皮細胞培養系を用いて空気暴露が分化進行に必要なメカニズムを解明する課題項目については、これまでに空気暴露の有無で差異のあった遺伝子群のなかから、低酸素応答に関する因子群が関与する可能性を新たに見出した。まず低酸素応答因子を制御する種々の薬剤を加えて、その関与が確実であることを確認した。また空気暴露の有無による分化の進行度の違いを、分化マーカー遺伝子を拡げて確認するとともに、従来用いていた初代培養細胞に加えて外来から遺伝子導入の容易な細胞株も含めて行った。これにより候補因子の欠損や過剰発現をさせて、その関与を解析することが可能になった。低酸素応答に関わるいくつかの因子について、レンチウイルスによる遺伝子導入発現システムを構築した。
一方、空気に接しないで表皮形成が行われる胎児の生育環境である羊水を、マウスおよびヤギから採取して解析を進めた。すでに羊水に表皮細胞分化を制御する因子の存在を確認していたので、それぞれ羊水をプロテアーゼ処理や熱処理を加えて、その効果が減じることからタンパク質成分と想定されることを明らかにした。また透析・限外ろ過によりおよその分子量サイズの情報も得た。これらの情報を得たのちに、イオン交換クロマトグラフィーを行って粗画分を得た。この中では、分化を促進する活性を確認できたことに加え、また分化マーカーの一つTG3（タンパク質架橋化酵素アイソザイム）の発現阻害活性を有する画分も別途に見出した。これらの活性画分を種々のアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製に用いられるかどうかを調べつつ、併せてゲルろ過クロマトグラフィーに供した。その結果、特定の画分として得ることができた。
細胞培養系において空気暴露が表皮分化刺激を与えるメカニズムの解明：ヒト表皮初代培養に加え、細胞株（Ker-CT）を用いて、改めて分化マーカーの種類を拡大して、空気暴露の有無での発現や角化度の違いを解析した。また、通常2週間で角化に至るところを、長期（8週）にわたって培養した際には空気暴露がない場合でも重層化することを見出した。しかし電子顕微鏡観察の結果からは著しく最外層に違いがあることを明らかにした。
空気暴露刺激が必須なメカニズムの解明に向けては、これまで行った発現遺伝子群の差異の解析（RNA-seq）結果から着目した、低酸素応答関連因子の関与について解析を進めた。低酸素応答の現象は、これまでも酸素分圧による様々な遺伝子発現制御を支配することが知られている。その情報を基に、まず関与を確実にするため数種の阻害剤・活性化剤を培養系に加えて変化が生じることを確認し、この刺激が細胞に伝達される際には低酸素応答が関与することを明らかにした。因子群を表皮細胞系に導入して発現・抑制するシステム作製も完了した。
羊水からの精製は、マウス・ヤギを給原に進めた。その際にまず、タンパク質成分が関与することを、羊水に対しプロテアーゼ・加熱・透析処理によって確認をした。該当年度はまず、マウスの大量の羊水を採取し、イオン交換クロマトグラフィーによって活性画分を追跡した。分画した羊水の活性は、表皮細胞への添加とその後の分化マーカー発現量で評価した。その結果、分化を促進する活性画分と、また別にタンパク質架橋化酵素TG3発現を特異的に抑制する画分があることを確認した。性状解析を主目的に、アフィニティークロマトグラフィーへの吸着を検討するとともに、分子サイズの推定できるゲルろ過クロマトグラフィーを行った。活性を分画物中に確認でき、含有される精製成分の同定は質量分析により可能であり進めている。
表皮培養の角化再現における空気暴露刺激において、低酸素応答の関与がひとつの可能性が有力と判明したので、関連する因子の遺伝子を入手するととともに、ヒト表皮細胞株を対象にしてレンチウイルス系での遺伝子導入を行う。この際、shRNAによる抑制、並びに過剰発現を行って、分化の度合いが影響されるかどうかを指標マーカーの増減を解析することで、その因果関係を確かめる。またシグナル伝達系について、阻害剤や影響のあった因子の下流で働く遺伝子群を調べて特定する。
併せて、長期培養により明らかになった、空気にさらさない場合での異常な重層(疑似角化)についても詳細な検討に入る。電子顕微鏡による観察をより詳細に行いつつ、長期に培養した際の遺伝子発現パターンの差異のデータ解析（RNA-seq）を、分化の後半においても行って、疑似角化と正常な角化に至る際の細胞内で生じる現象の違いを推測する。
羊水については、マウスを給原とした場合に、複数のクロマトグラフィーによって、一定の段階まで精製を進めることができたので、大量の入手が可能なヤギ羊水（研究分担者：大蔵）およびトリ有精卵（分担者：村井）とともに採取を進める。これらの精製をマウスでの精製で得られた情報を基にして進め、分化促進活性画分ならびにTG3（タンパク質架橋化酵素）の発現抑制活性画分の最終精製をめざす。すでにマウスについては質量分析による、同定を一部進めており、それとも比較検討をしながら、多段階の精製を行って最終同定する。
ヤギ羊水については将来的に、今回の精製成分を含め、含有成分が胎仔形成やその後成長における影響があるかを解析することを目指している。そのため羊水の部分採取を試み、既知の分化促進因子が解析できるかどうかを調べる。またこれまで代表者が得た、マウスの胎生段階における羊水解析結果も踏まえてその存在の検出系確立や測定も試みる。 -
鳥類と哺乳類におけるPLA2R受容体の生理機能の発掘：血中抗体の延命化機構の解明
研究課題/研究課題番号：20K21369 2020年7月 - 2022年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
配分額：6370000円 （ 直接経費：4900000円 、 間接経費：1470000円 ）
ホスホリパーゼA2受容体（PLA2R）血中のホスホリパーゼA2酵素を速やかに除去するための受容体として哺乳類で最初に発見されました。我々は、鳥類ではPLA2Rのはたらきを抑制すると血液中の抗体濃度が著しく低下することを発見しました。よって、鳥類のPLA2Rと哺乳類のPLA2Rは全く異なる機能を持つことが推測されました。本研究では、鳥類のPLA2Rが血液を循環する抗体の寿命を延ばすはたらきを持つとの仮説を立て、これを証明します。また、哺乳類のPLA2Rが鳥類と同様の機能を持つのかについても調査します。
鳥類のPLA2Rによる血中抗体の延命化の仕組みを調査するとともに、鳥類のPLA2Rと哺乳類のPLA2Rとの間で、抗体受容体としての機能に違いがあるのかを明らかにすることを目的に研究を推進した。得られた結果の概要は以下の通りである。
1) 細胞レベルでの探索：MDCK細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞株）に、ニワトリPLA2Rの発現ベクターを遺伝子導入し、恒久的にPLA2Rを発現するMDCK細胞株を樹立した。また、空ベクターを遺伝子導入した対照となるMock細胞株も樹立した。
2) これらの細胞株にIgGを取り込ませて、それらが分解を受けることなく再び細胞から放出されるリサイクリング（循環）や細胞を横断するトランスサイトーシスがPLA2Rにより増強されるのか調査を進めている。
3) 個体レベルでの探索：ニワトリPLA2Rの抗体受容体機能を中和化する抗体をウズラに投与した後、外因的に投与した標識IgGの血中濃度を経時的に測定し、血中半減期を測定した。その結果、中和抗体の投与は、血中の標識IgGに加えて内因性IgGの半減期を短かくすることが判明した。よって、鳥類では、PLA2Rの抗体受容体機能が、血中IgGの延命化の鍵分子であることが判明した。
4) 哺乳類のPLA2Rが抗体受容体機能を有するのかを調査するために、ヒトPLA2Rの組換えタンパク質を哺乳類細胞で作出するための発現ベクターの構築に着手した。ヒト腎臓組織のcDNAライブラリーからヒトPLA2Rのクローニングし、現在ベクターの構築とヒトPLA2Rタンパク質の作出を進めている。
研究全体を通して、概ね順調に進んでいるものの、細胞レベルでのPLA2R機能の探索で資材入手が困難となっている。既に確立した恒久的にニワトリPLA2Rを発現するMDCK細胞株を使って、IgGのリサイクリングやトランスサイトーシスを調査しようとしたが、この調査に必須なトランスウェルの生産が世界規模で停滞しており、入手することができず中断を余儀なくされている。新型コロナウィルスの感染拡大の影響との報告を受けている。
上述した通り、細胞レベルでのPLA2R機能の探索に必要なトランスウェルの入手が困難となっている。この器具の入手か叶わない場合は、通常の細胞培養用ウェルを用いて、リサイクリング機能のみを探索する研究手法に切り替える。
また、ヒトPLA2Rのクローニングの結果、データベース上に登録されているPLA2R遺伝子とは配列が一部異なっていることがわかっている。データベースに登録されているヒトPLA2R遺伝子は米国のメーカーで市販されているため、この遺伝子を用いたヒトPLA2Rの発現ベクターも構築も同時に進める。 -
暑熱ニワトリの摂食低下機構の解明：腸管バリア機能破綻を起点とした脳摂食抑制の検証
研究課題/研究課題番号：20H03123 2020年4月 - 2023年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
喜久里 基, 米山 裕, 村井 篤嗣, 小島 創一, 橘 哲也
担当区分：研究分担者
暑熱環境下において肉用鶏は成長が低下する。これは、酸化ストレスや炎症、腸管機能低下といったニワトリの身体の不調と飼料摂取量の低下（≒栄養不足）に原因がある。本研究では、暑熱下ではなぜ飼料摂取量が減るのか、その原因メカニズムを解明するため、近年、注目されている腸管機能と摂食行動との関連性を検証する。
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PLA2R受容体による鳥類卵黄への抗体輸送機構の解明と高IgY卵創出への応用
2020年4月 - 2023年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：7540000円 （ 直接経費：5800000円 、 間接経費：1740000円 ）
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PLA2R受容体による鳥類卵黄への抗体輸送機構の解明と高IgY卵創出への応用
研究課題/研究課題番号：20H03128 2020年4月 - 2023年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
村井 篤嗣, 水島 秀成
担当区分：研究代表者
配分額：17680000円 （ 直接経費：13600000円 、 間接経費：4080000円 ）
鳥類の卵黄には感染防御能を持つIgY抗体が蓄積しており、次世代ヒナの免疫能の強化に必須である。このIgYの輸送は卵胞に存在するIgY受容体との結合により行われると考えられているが、その同定例はない。本研究では、候補受容体として着目した「ホスホリパーゼA2受容体（=PLA2R）」が卵黄へのIgY輸送を担う受容体であることを証明し、この輸送の分子機構を解明することを目的とする。さらに、PLA2Rへの結合を強化した新しいIgY変異体を創出して、高IgY卵の創出を目指す。
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モミ米摂取による腸管免疫バリア機能の増強と薬剤フリー鶏育成への挑戦
2017年6月 - 2019年3月
科学研究費補助金 研究成果公開促進費 (研究成果公開発表)
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モミ米摂取による腸管免疫バリア機能の増強と薬剤フリー鶏育成への挑戦
研究課題/研究課題番号：17K19321 2017年6月 - 2019年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
村井 篤嗣, 堀尾 文彦
担当区分：研究代表者
配分額：6240000円 （ 直接経費：4800000円 、 間接経費：1440000円 ）
ニワトリは破砕能力に優れた筋胃を持つ特性により強固な物性を持つモミ米をそのまま利用できる。本研究では、モミ米摂取によるニワトリ腸管での生理的変化を網羅的遺伝子発現解析により捉え、この解析によって顕著に減少することが判明したIgA抗体産生への影響を調査した。DNAマイクロアレイ解析により、モミ米摂取は小腸におけるIgA構成遺伝子の発現を減少させることが判明した。また、モミ米摂取はワクチン暴露による特異的なIgA抗体の産生も減少させた。モミ米摂取は盲腸内で産生される短鎖脂肪酸産生量を減少させたことから、モミ米の発酵基質としての特性がIgA抗体産生減少の一因と考えられた。
本研究により、モミ米を摂取したニワトリでは腸管におけるIgA抗体の産生が減弱化することが初めて明らかとなった。この結果は、モミ米摂取により腸管からの病原菌侵入が容易になることを示すわけではないが、モミ米を使用する生産者にとっては懸念材料となる。モミ米の摂取時に、発酵性食物繊維を加えることで腸管IgAの産生を回復できる可能性が示されたことから、生産者が安心してモミ米を利用し、国産飼料資源としてのモミ米の地位確立に貢献できる成果である。 -
IgY欠損鶏を用いた新規アプローチによる鳥類の母子免疫機構の解明
2016年4月 - 2020年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
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IgY欠損鶏を用いた新規アプローチによる鳥類の母子免疫機構の解明
研究課題/研究課題番号：16H05020 2016年4月 - 2020年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
配分額：17160000円 （ 直接経費：13200000円 、 間接経費：3960000円 ）
IgYは、母ドリの血中から卵黄に取り込まれ、次世代ヒナの免疫能の強化に必須である。このIgYの取り込みは受容体との結合により行われるが、同定例はない。IgY欠損鶏と通常鶏の卵母細胞での遺伝子発現量を網羅的に比較解析することで、このIgY受容体を発掘しようとした。IgY欠損鶏で対照鶏よりも遺伝子発現レベルが上昇した遺伝子の中から、LRP2LとFcRYの２つの受容体候補遺伝子を選抜した。組換えタンパク質で発現させたこれら受容体のうち、LRP2LはIgYと結合しないが、FcRYはIgYと結合した。本研究より、鳥類の母子免疫では卵胞で発現するFcRYが血中IgYの卵黄輸送に関与する可能性が示された。
母体の免疫成分が新生仔に継承される現象は母子免疫と呼ばれ、鳥類では、母ドリの血中抗体IgYが大量に卵黄へ取り込まれる。この現象は100年以上も前から知られているが、その分子機構は今日まで解明されていない。本研究で候補受容体として選抜されたFcRY受容体は卵黄のIgY量を決定する鍵因子であり、この受容体の発現レベルと受容体機能の優劣を選抜指標とすれば、高卵黄IgY形質を持つニワトリ系統を開発することが出来る。このニワトリ系統はIgYの増産を可能とし、さらに、ヒナの免疫能が増強されることから、卵を利用した新しい産業の創出に繋がることが期待できる。 -
鳥類卵胞においてＩｇＹ輸送量を制御する鍵因子の解明
2007年4月 - 2009年3月
科学研究費補助金 基盤研究（Ｃ）（一般），課題番号：19580310
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
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幼雛期における体温調節メカニズムの解明
2006年4月 - 2009年3月
科学研究費補助金
古瀬充宏
担当区分：研究分担者
科学研究費補助金
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鳥類卵胞における選択的抗体輸送機構の解明と機能性卵開発への応用
2005年4月 - 2007年3月
科学研究費補助金 若手研究（Ｂ），課題番号：17780210
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
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脂質代謝系転写因子の複合調節による体エネルギー分配の改変
2003年4月 - 2005年3月
科学研究費補助金 若手研究（Ｂ），課題番号：15780179
村井 篤嗣
担当区分：研究代表者
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非ウイルス性生体遺伝子導入による摂食量改善と成長促進
2003年4月 - 2005年3月
科学研究費補助金 基盤研究（B）（２）
村松達夫
担当区分：研究分担者
科学研究費補助金
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栄養素摂取による腸管MAPキナーゼ経路の活性化機構と生理機能の解明
2001年4月 - 2003年3月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者
科研費
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消化管ホルモン分泌細胞における転写制御因子活性化機構の解明
1998年7月 - 1999年1月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者
科研費