Updated on 2022/04/12

写真a

 
Hanafusa, Hiroshi
 
Organization
Graduate School of Science Associate professor
Graduate School
Graduate School of Science
Undergraduate School
School of Science Department of Biological Science
Title
Associate professor
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Degree 1

  1. 理学博士 ( 2001.3   京都大学 ) 

Research Interests 6

  1. 細胞内小胞輸送

  2. LRRK1

  3. MAPキナーゼ

  4. EGFRシグナル

  5. エンドサイトーシス

  6. 細胞増殖シグナル

Research Areas 2

  1. Others / Others  / Cell Biology

  2. Others / Others  / Molecular Biology

Current Research Project and SDGs 3

  1. 細胞内メンブレントラフィックの解析

  2. 細胞内オルガネラシグナリング

  3. 神経変性疾患の発症メカニズムの解析

Research History 4

  1. Nagoya University   Graduate School of Science Division of Biological Science Cell Regulation   Associate professor

    2015.9

      More details

  2. Nagoya University   Graduate School of Science Division of Biological Science Cell Regulation   Lecturer

    2013.12 - 2015.8

      More details

  3. Nagoya University   Graduate School of Science Division of Biological Science   Assistant Professor

    2007.4 - 2013.11

      More details

  4. Nagoya University   Assistant

    2002.3 - 2007.3

      More details

    Country:Japan

Education 2

  1. Kyoto University   Graduate School, Division of Natural Science

    1996.4 - 2001.3

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    Country: Japan

  2. Kyoto University   Faculty of Science

    1992.4 - 1996.3

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    Country: Japan

Professional Memberships 1

  1. 分子生物学会

 

Papers 29

  1. TDP2 negatively regulates axon regeneration by inducing SUMOylation of an Ets transcription factor Reviewed

    Sakai Yoshiki, Hanafusa Hiroshi, Pastuhov Strahil Iv, Shimizu Tatsuhiro, Li Chun, Hisamoto Naoki, Matsumoto Kunihiro

    EMBO REPORTS   Vol. 20 ( 10 ) page: e47517   2019.10

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    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:EMBO Reports  

    In Caenorhabditis elegans, the JNK MAP kinase (MAPK) pathway is important for axon regeneration. The JNK pathway is activated by a signaling cascade consisting of the growth factor SVH-1 and its receptor tyrosine kinase SVH-2. Expression of the svh-2 gene is induced by axonal injury in a process involving the transcription factors ETS-4 and CEBP-1. Here, we find that svh-14/mxl-1, a gene encoding a Max-like transcription factor, is required for activation of svh-2 expression in response to axonal injury. We show that MXL-1 binds to and inhibits the function of TDPT-1, a C. elegans homolog of mammalian tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2 [TDP2; also called Ets1-associated protein II (EAPII)]. Deletion of tdpt-1 suppresses the mxl-1 defect, but not the ets-4 defect, in axon regeneration. TDPT-1 induces SUMOylation of ETS-4, which inhibits ETS-4 transcriptional activity, and MXL-1 counteracts this effect. Thus, TDPT-1 interacts with two different transcription factors in axon regeneration.

    DOI: 10.15252/embr.201847517

    Web of Science

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  2. LRRK1 phosphorylation of Rab7 at S72 links trafficking of EGFR-containing endosomes to its effector RILP Reviewed

    Hanafusa Hiroshi, Yagi Takuya, Ikeda Haruka, Hisamoto Naoki, Nishioka Tomoki, Kaibuchi Kozo, Shirakabe Kyoko, Matsumoto Kunihiro

    JOURNAL OF CELL SCIENCE   Vol. 132 ( 11 )   2019.6

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of cell science  

    Ligand-induced activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) initiates trafficking events that re-localize the receptor from the cell surface to intracellular endocytic compartments. EGFR-containing endosomes are transported to lysosomes for degradation by the dynein-dynactin motor protein complex. However, this cargo-dependent endosomal trafficking mechanism remains largely uncharacterized. Here, we show that GTP-bound Rab7 is phosphorylated on S72 by leucine-rich repeat kinase 1 (LRRK1) at the endosomal membrane. This phosphorylation promotes the interaction of Rab7 (herein referring to Rab7a) with its effector RILP, resulting in recruitment of the dynein-dynactin complex to Rab7-positive vesicles. This, in turn, facilitates the dynein-driven transport of EGFR-containing endosomes toward the perinuclear region. These findings reveal a mechanism regulating the cargo-specific trafficking of endosomes.

    DOI: 10.1242/jcs.228809

    Web of Science

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  3. LRRK1 regulates spindle orientation by phosphorylating CDK5RAP2 Invited

    Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro

    CELL CYCLE   Vol. 14 ( 21 ) page: 3349 - 3350   2015.11

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publisher:Cell Cycle  

    DOI: 10.1080/15384101.2015.1093446

    Web of Science

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  4. PLK1-dependent activation of LRRK1 regulates spindle orientation by phosphorylating CDK5RAP2 Reviewed

    Hanafusa Hiroshi, Kedashiro Shin, Tezuka Motohiro, Funatsu Motoki, Usami Satoshi, Toyoshima Fumiko, Matsumoto Kunihiro

    NATURE CELL BIOLOGY   Vol. 17 ( 8 ) page: 1024 - U360   2015.8

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Nature Cell Biology  

    Correct formation of the cell division axis requires the initial precise orientation of the mitotic spindle. Proper spindle orientation depends on centrosome maturation, and Polo-like kinase 1 (PLK1) is known to play a crucial role in this process. However, the molecular mechanisms that function downstream of PLK1 are not well understood. Here we show that LRRK1 is a PLK1 substrate that is phosphorylated on Ser 1790. PLK1 phosphorylation is required for CDK1-mediated activation of LRRK1 at the centrosomes, and this in turn regulates mitotic spindle orientation by nucleating the growth of astral microtubules from the centrosomes. Interestingly, LRRK1 in turn phosphorylates CDK5RAP2(Cep215), a human homologue of Drosophila Centrosomin (Cnn), in its γ-tubulin-binding motif, thus promoting the interaction of CDK5RAP2 with γ-tubulin. LRRK1 phosphorylation of CDK5RAP2 Ser 140 is necessary for CDK5RAP2-dependent microtubule nucleation. Thus, our findings provide evidence that LRRK1 regulates mitotic spindle orientation downstream of PLK1 through CDK5RAP2-dependent centrosome maturation.

    DOI: 10.1038/ncb3204

    Web of Science

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  5. LRRK1-phosphorylated CLIP-170 regulates EGFR trafficking by recruiting p150Glued to microtubule plus-ends Reviewed

    Shin Kedashiro, Strahil Iv. Pastuhov, Tomoki Nishioka, Takashi Watanabe, Kozo Kaibuchi, Kunihiro Matsumoto, and Hiroshi Hanafusa

    Journal of Cell Science   Vol. 128 ( 2 ) page: 385 - 396   2015.1

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1242/jcs.161547

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  6. EGFR-dependent phosphorylation of leucine-rich repeat kinase LRRK1 is important for proper endosomal trafficking of EGFR Reviewed

    Kouki Ishikawaa, Atsuki Narab, Kunihiro Matsumotoa, and Hiroshi Hanafusa

    Molecular Biology of the Cell   Vol. 23 ( 7 ) page: 1294 - 1306   2012.4

     More details

    Authorship:Last author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    Ligand-induced activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) initi- ates trafficking events that relocalize the receptors from the cell surface to intracellular endo- cytic compartments. We recently reported that leucine-rich repeat kinase 1 (LRRK1) is in- volved in the trafficking of EGFR from early to late endosomes. In this study, we demonstrate that EGFR regulates the kinase activity of LRRK1 via tyrosine phosphorylation and that this is required for proper endosomal trafficking of EGFR. Phosphorylation of LRRK1 at Tyr-944 re- sults in reduced LRRK1 kinase activity. Mutation of LRRK1 Tyr-944 (Y944F) abolishes EGF- stimulated tyrosine phosphorylation, resulting in hyperactivation of LRRK1 kinase activity and enhanced motility of EGF-containing endosomes toward the perinuclear region. The com- partments in which EGFR accumulates are mixed endosomes and are defective in the proper formation of intraluminal vesicles of multivesicular bodies. These results suggest that feed- back down-regulation of LRRK1 kinase activity by EGFR plays an important role in the appro- priate endosomal trafficking of EGFR.

    DOI: 10.1091/mbc.E11-09-0780

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  7. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor Reviewed

    Hanafusa Hiroshi, Ishikawa Kouki, Kedashiro Shin, Saigo Tsukasa, Iemura Shun-ichiro, Natsume Tohru, Komada Masayuki, Shibuya Hiroshi, Nara Atsuki, Matsumoto Kunihiro

    NATURE COMMUNICATIONS   Vol. 2 ( 1 ) page: 158   2011.1

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Nature Communications  

    Activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) not only initiates multiple signal-transduction pathways, including the MAP kinase (MAPK) pathway, but also triggers trafficking events that relocalize receptors from the cell surface to intracellular endocytic compartments. In this paper, we demonstrate that leucine-rich repeat kinase LRRK1, which contains a MAPKKK-like kinase domain, forms a complex with activated EGFR through an interaction with Grb2. Subsequently, LRRK1 and epidermal growth factor (EGF) are internalized and co-localized in early endosomes. LRRK1 regulates EGFR transport from early to late endosomes and regulates the motility of EGF-containing early endosomes in a manner dependent on its kinase activity. Furthermore, LRRK1 serves as a scaffold facilitating the interaction of EGFR with the endosomal sorting complex required for transport-0 complex, thus enabling efficient sorting of EGFR to the inner vesicles of multivesicular bodies. Our findings provide the first evidence that a MAPKKK-like protein regulates the endosomal trafficking of EGFR. © 2011 Macmillan Publishers Limited. All rights reserved.

    DOI: 10.1038/ncomms1161

    Web of Science

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  8. Regulation of ERK activity duration by Sprouty contributes to dorsoventral patterning Reviewed

    Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro, Nishida Eisuke

    NATURE CELL BIOLOGY   Vol. 11 ( 1 ) page: 106 - U222   2009.1

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Nature Cell Biology  

    Distinct modes of ERK activation, sustained or transient, are essential for cell fate decision in cultured cells. Here we show that Xenopus laevis Sprouty2 (XSpry2) controls the duration of ERK activity and thereby contributes to the establishment of dorsoventral patterning during mesoderm formation. Furthermore, Xenopus Fos (XFos) can function as a molecular sensor of the ERK signalling duration in Xenopus embryos. This work provides the first evidence that regulating the duration of ERK activity contributes to cell fate decisions in the context of the whole organism.

    DOI: 10.1038/ncb1820

    Web of Science

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    PubMed

  9. Shp2, an SH2-containing protein-tyrosine phosphatase, positively regulates receptor tyrosine kinase signaling by dephosphorylating and inactivating the inhibitor sprouty Reviewed

    Hanafusa H, Torii S, Yasunaga T, Matsumoto K, Nishida E

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   Vol. 279 ( 22 ) page: 22992 - 22995   2004.5

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Biological Chemistry  

    Src homology 2-containing phosphotyrosine phosphatase (Shp2) functions as a positive effector in receptor tyrosine kinase (RTK) signaling immediately proximal to activated receptors. However, neither its physiological substrate(s) nor its mechanism of action in RTK signaling has been defined. In this study, we demonstrate that Sprouty (Spry) is a possible target of Shp2. Spry acts as a conserved inhibitor of RTK signaling, and tyrosine phosphorylation of Spry is indispensable for its inhibitory activity. Shp2 was able to dephosphorylate fibroblast growth factor receptor-induced phosphotyrosines on Spry both in vivo and in vitro. Shp2-mediated dephosphorylation of Spry resulted in dissociation of Spry from Grb2. Furthermore, Shp2 could reverse the inhibitory effect of Spry on FGF-induced neurite outgrowth and MAP kinase activation. These findings suggest that Shp2 acts as a positive regulator in RTK signaling by dephosphorylating and inactivating Spry.

    DOI: 10.1074/jbc.M312498200

    Web of Science

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  10. Sprouty1 and Sprouty2 provide a control mechanism for the Ras/MAPK signalling pathway Reviewed

    Hanafusa H, Torii S, Yasunaga T, Nishida E

    NATURE CELL BIOLOGY   Vol. 4 ( 11 ) page: 850 - 858   2002.11

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Nature Cell Biology  

    Sprouty (Spry) inhibits signalling by receptor tyrosine kinases; however, the molecular mechanism underlying this function has not been defined. Here we show that after stimulation by growth factors Spry1 and Spry2 translocate to the plasma membrane and become phosphorylated on a conserved tyrosine. Next, they bind to the adaptor protein Grb2 and inhibit the recruitment of the Grb2-Sos complex either to the fibroblast growth factor receptor (FGFR) docking adaptor protein FRS2 or to Shp2. Membrane translocation of Spry is necessary for its phosphorylation, which is essential for its inhibitor activity. A tyrosine-phosphorylated octapeptide derived from mouse Spry2 inhibits Grb2 from binding FRS2, Shp2 or mouse Spry2 in vitro and blocks activation of the extracellular-signal-regulated kinase (ERK) in cells stimulated by growth factor. A non-phosphorylated Spry mutant cannot bind Grb2 and acts as a dominant negative, inducing prolonged activation of ERK in response to FGF and promoting the FGF-induced outgrowth of neurites in PC12 cells. Our findings suggest that Spry functions in a negative feedback mechanism in which its inhibitor activity is controlled rapidly and reversibly by post-translational mechanisms.

    DOI: 10.1038/ncb867

    Web of Science

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  11. The TGF-beta family member derriere is involved in regulation of the establishment of left-right asymmetry Reviewed

    Hanafusa H, Masuyama N, Kusakabe M, Shibuya H, Nishida E

    EMBO REPORTS   Vol. 1 ( 1 ) page: 32 - 39   2000.7

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:EMBO Reports  

    Although a number of genes that are involved in the establishment of left-right asymmetry have been identified, earlier events in the molecular pathway developing left-right asymmetry remain to be elucidated. Here we present evidence suggesting that the transforming growth factor-β family member derrière is involved in the development of left-right asymmetry in Xenopus embryos. Ectopic expression of derrière on the right side can fully invert cardiac and visceral left-right orientation and nodal expression, and expression of a dominant-negative form of derrière on the left side can partially randomize the left-right orientation and nodal expression. Moreover, while expression of the dominant-negative derrière does not inhibit the activity of Vg1 directly, it can rescue the altered left-right orientation induced by Vg1. Vg1 can induce derrière in animal cap explants. These results suggest that derrière is involved in earlier molecular pathways developing the left-right asymmetry. © 2000 European Molecular Biology Organization.

    DOI: 10.1093/embo-reports/kvd008

    Web of Science

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  12. Involvement of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in transforming growth factor-beta-induced gene expression. Reviewed

    Hanafusa H, Ninomiya-Tsuji J, Masuyama N, Nishita M, Fujisawa J, Shibuya H, Matsumoto K, Nishida E

    The Journal of biological chemistry   Vol. 274 ( 38 ) page: 27161 - 7   1999.9

     More details

    Authorship:Lead author   Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Biological Chemistry  

    Transforming growth factor-β (TGF-β)-activated kinase 1 (TAK1), a member of the mitogen-activated protein kinase kinase kinase family, is suggested to be involved in TGF-β-induced gene expression, but the signaling mechanism from TAK1 to the nucleus remains largely undefined. We have found that p38 mitogen-activated protein kinase, and its direct activator MKK6 are rapidly activated in response to TGF-β. Expression of dominant negative MKK6 or dominant negative TAK1 inhibited the TGF-β-induced transcriptional activation as well as the p38 activation. Constitutive activation of the p38 pathway in the absence of TGF-β induced the transcriptional activation, which was enhanced synergistically by coexpression of Smad2 and Smad4 and was inhibited by expression of the C-terminal truncated, dominant negative Smad4. Furthermore, we have found that activating transcription factor-2 (ATF-2), which is known as a nuclear target of p38, becomes phosphorylated in the N- terminal activation domain in response to TGF-β, that ATF-2 forms a complex with Smad4, and that the complex formation is enhanced by TGF-β. In addition, expression of a nonphosphorylatable form of ATF-2 inhibited the TGF-β-induced transcriptional activation. These results show that the p38 pathway is activated by TGF-β and is involved in the TGF-β-induced transcriptional activation by regulating the Smad-mediated pathway.

    DOI: 10.1074/jbc.274.38.27161

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  13. CDK14 Promotes Axon Regeneration by Regulating the Noncanonical Wnt Signaling Pathway in a Kinase-Independent Manner Reviewed

    Hisamoto Naoki, Sakai Yoshiki, Ohta Kohei, Shimizu Tatsuhiro, Li Chun, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro

    JOURNAL OF NEUROSCIENCE   Vol. 41 ( 40 ) page: 8309 - 8320   2021.10

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Neuroscience  

    The postinjury regenerative capacity of neurons is known to be mediated by a complex interaction of intrinsic regenerative pathways and external cues. In Caenorhabditis elegans, the initiation of axon regeneration is regulated by the nonmuscle myosin light chain-4 (MLC-4) phosphorylation signaling pathway. In this study, we have identified svh-16/cdk-14, a mammalian CDK14 homolog, as a positive regulator of axon regeneration in motor neurons. We then isolated the CDK-14-binding protein MIG-5/Disheveled (Dsh) and found that EGL-20/Wnt and the MIG-1/Frizzled receptor (Fz) are required for efficient axon regeneration. Further, we demonstrate that CDK-14 activates EPHX-1, the C. elegans homolog of the mammalian ephexin Rho-type GTPase guanine nucleotide exchange factor (GEF), in a kinase-independent manner. EPHX-1 functions as a GEF for the CDC-42 GTPase, inhibiting myosin phosphatase, which maintains MLC-4 phosphorylation. These results suggest that CDK14 activates the RhoGEF-CDC42-MLC phosphorylation axis in a noncanonical Wnt signaling pathway that promotes axon regeneration.

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.0711-21.2021

    Web of Science

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  14. The Integrin Signaling Network Promotes Axon Regeneration via the Src-Ephexin-RhoA GTPase Signaling Axis Reviewed

    Sakai Yoshiki, Tsunekawa Mayuka, Ohta Kohei, Shimizu Tatsuhiro, Pastuhov Strahil Iv., Hanafusa Hiroshi, Hisamoto Naoki, Matsumoto Kunihiro

    JOURNAL OF NEUROSCIENCE   Vol. 41 ( 22 ) page: 4754 - 4767   2021.6

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Neuroscience  

    Axon regeneration is an evolutionarily conserved process essential for restoring the function of damaged neurons. In Caenorhabditis elegans hermaphrodites, initiation of axon regeneration is regulated by the RhoA GTPase–ROCK (Rho-associated coiled-coil kinase)–regulatory nonmuscle myosin light-chain phosphorylation signaling pathway. However, the upstream mechanism that activates the RhoA pathway remains unknown. Here, we show that axon injury activates TLN-1/talin via the cAMP–Epac (exchange protein directly activated by cAMP)–Rap GTPase cascade and that TLN-1 induces multiple downstream events, one of which is integrin inside-out activation, leading to the activation of the RhoA–ROCK signaling pathway. We found that the nonreceptor tyrosine kinase Src, a key mediator of integrin signaling, activates the Rho guanine nucleotide exchange factor EPHX-1/ephexin by phosphorylating the Tyr-568 residue in the autoinhibitory domain. Our results suggest that the C. elegans integrin signaling network regulates axon regeneration via the Src–RhoGEF–RhoA axis.

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2456-20.2021

    Web of Science

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  15. BRCA1-BARD1 Regulates Axon Regeneration in Concert with the Gq alpha-DAG Signaling Network Reviewed

    Sakai Yoshiki, Hanafusa Hiroshi, Shimizu Tatsuhiro, Pastuhov Strahil I., Hisamoto Naoki, Matsumoto Kunihiro

    JOURNAL OF NEUROSCIENCE   Vol. 41 ( 13 ) page: 2842 - 2853   2021.3

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Neuroscience  

    The breast cancer susceptibility protein BRCA1 and its partner BRCA1-associated RING domain protein 1 (BARD1) form an E3-ubiquitin (Ub) ligase complex that acts as a tumor suppressor in mitotic cells. However, the roles of BRCA1-BARD1 in postmitotic cells, such as neurons, remain poorly defined. Here, we report that BRC-1 and BRD-1, the Caenorhabditis elegans orthologs of BRCA1 and BARD1, are required for adult-specific axon regeneration, which is positively regulated by the EGL-30 Gqa-diacylglycerol (DAG) signaling pathway. This pathway is downregulated by DAG kinase (DGK), which converts DAG to phosphatidic acid (PA). We demonstrate that inactivation of DGK-3 suppresses the brc-1 brd-1 defect in axon regeneration, suggesting that BRC-1-BRD-1 inhibits DGK-3 function. Indeed, we show that BRC-1-BRD-1 poly-ubiquitylates DGK-3 in a manner dependent on its E3 ligase activity, causing DGK-3 degradation. Furthermore, we find that axon injury causes the translocation of BRC-1 from the nucleus to the cytoplasm, where DGK-3 is localized. These results suggest that the BRC-1-BRD-1 complex regulates axon regeneration in concert with the Gqa-DAG signaling network. Thus, this study describes a new role for breast cancer proteins in fully differentiated neurons and the molecular mechanism underlying the regulation of axon regeneration in response to nerve injury.

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1806-20.2021

    Web of Science

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  16. Caenorhabditis elegans F-Box Protein Promotes Axon Regeneration by Inducing Degradation of the Mad Transcription Factor Reviewed

    Shimizu Tatsuhiro, Pastuhov Strahil I., Hanafusa Hiroshi, Sakai Yoshiki, Todoroki Yasuko, Hisamoto Naoki, Matsumoto Kunihiro

    JOURNAL OF NEUROSCIENCE   Vol. 41 ( 11 ) page: 2373 - 2381   2021.3

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1024-20.2021

    Web of Science

    PubMed

  17. C. elegans Tensin Promotes Axon Regeneration by Linking the Met-like SVH-2 and Integrin Signaling Pathways Reviewed

    Hisamoto Naoki, Shimizu Tatsuhiro, Asai Kazuma, Sakai Yoshiki, Pastuhov Strahil I, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro

    JOURNAL OF NEUROSCIENCE   Vol. 39 ( 29 ) page: 5662 - 5672   2019.7

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Neuroscience  

    Axon regeneration is a conserved mechanism induced by axon injury that initiates a neuronal response leading to regrowth of the axon. In Caenorhabditis elegans, the initiation of axon regeneration is regulated by the JNK MAP kinase (MAPK) pathway. We have previously identified a number of genes affecting the JNK pathway using an RNAi-based screen. Analysis of these genes, called the svhgenes, has shed new light on the regulation of axon regeneration, revealing the involvement of a signaling cascade consisting of a growth factor SVH-1 and its receptor, the tyrosine kinase SVH-2. Here, we characterize the svh-6/tns-1 gene, which is a homolog of mammalian tensin, and show that it is a positive regulator of axon regeneration in motor neurons. We demonstrate that TNS-1 interacts with tyrosine-autophosphorylated SVH-2 and the integrin β subunit PAT-3 via its SH2 and PTB domains, respectively, to promote axon regeneration. These results suggest that TNS-1 acts as an adaptor to link the SVH-2 and integrin signaling pathways.

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2059-18.2019

    Web of Science

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  18. 特集 細胞高次機能をつかさどるオルガネラコミュニケーション Ⅱ.ゴルジ体およびポストゴルジネットワーク チロシンキナーゼ型受容体EGFRの細胞内トラフィック Invited

    花房 洋

    生体の科学   Vol. 69 ( 6 ) page: 573 - 576   2018.12

     More details

    Authorship:Lead author   Language:Japanese   Publisher:株式会社医学書院  

    DOI: 10.11477/mf.2425200925

    CiNii Research

  19. The C. elegans BRCA2-ALP/Enigma Complex Regulates Axon Regeneration via a Rho GTPase-ROCK-MLC Phosphorylation Pathway Reviewed

    Shimizu Tatsuhiro, Pastuhov Strahil Iv, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro, Hisamoto Naoki

    CELL REPORTS   Vol. 24 ( 7 ) page: 1880 - 1889   2018.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Cell Reports  

    The ability of specific neurons to regenerate their axons after injury is governed by cell-intrinsic regeneration pathways. However, the mechanisms regulating axon regeneration are not well understood. Here, we identify the brc-2 gene encoding a homolog of the mammalian BRCA2 tumor suppressor as a regulator of axon regeneration in Caenorhabditis elegans motor neurons. We show that the RHO-1/Rho GTPase-LET-502/ROCK (Rho-associated coiled-coil kinase)-regulatory non-muscle myosin light-chain (MLC-4/MLC) phosphorylation signaling pathway regulates axon regeneration. BRC-2 functions between RHO-1 and LET-502, suggesting that BRC-2 is required for the activation of LET-502 by RHO-1-GTP. We also find that one component that interacts with BRC-2, the ALP (α-actinin-associated LIM protein)/Enigma protein ALP-1, is required for regeneration and acts between LET-502 and MLC-4 phosphorylation. Furthermore, we demonstrate that ALP-1 associates with LET-502 and MLC-4. Thus, ALP-1 serves as a platform to activate MLC-4 phosphorylation mediated by the RHO-1–LET-502 signaling pathway. Shimizu et al. demonstrate that a BRCA2 homolog BRC-2 and its binding partner, the ALP/Enigma protein ALP-1, regulate axon regeneration via the Rho-ROCK-MLC signaling pathway in C. elegans. ALP-1 serves as a platform to activate MLC phosphorylation, which promotes growth cone formation of severed axons.

    DOI: 10.1016/j.celrep.2018.07.049

    Web of Science

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    PubMed

  20. Phosphatidylserine exposure mediated by ABC transporter activates the integrin signaling pathway promoting axon regeneration Reviewed

    Hisamoto Naoki, Tsuge Anna, Pastuhov Strahil Iv, Shimizu Tatsuhiro, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro

    NATURE COMMUNICATIONS   Vol. 9 ( 1 ) page: 3099   2018.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Nature Communications  

    Following axon injury, a cascade of signaling events is triggered to initiate axon regeneration. However, the mechanisms regulating axon regeneration are not well understood at present. In Caenorhabditis elegans, axon regeneration utilizes many of the components involved in phagocytosis, including integrin and Rac GTPase. Here, we identify the transthyretin (TTR)-like protein TTR-11 as a component functioning in axon regeneration upstream of integrin. We show that TTR-11 binds to both the extracellular domain of integrin-α and phosphatidylserine (PS). Axon injury induces the accumulation of PS around the injured axons in a manner dependent on TTR-11, the ABC transporter CED-7, and the caspase CED-3. Furthermore, we demonstrate that CED-3 activates CED-7 during axon regeneration. Thus, TTR-11 functions to link the PS injury signal to activation of the integrin pathway, which then initiates axon regeneration.

    DOI: 10.1038/s41467-018-05478-w

    Web of Science

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  21. [Regulation of cellular function by ROCO family kinase LRRK1 in a manner dependent on its substrates]. Invited

    Hanafusa H, Matsumoto K

    Seikagaku. The Journal of Japanese Biochemical Society   Vol. 89 ( 2 ) page: 286 - 9   2017.4

     More details

    Authorship:Lead author   Language:Japanese  

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  22. TAK1 determines susceptibility to endoplasmic reticulum stress and leptin resistance in the hypothalamus Reviewed International coauthorship

    Sai Kazuhito, Morioka Sho, Takaesu Giichi, Muthusamy Nagendran, Ghashghaei H. Troy, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro, Ninomiya-Tsuji Jun

    JOURNAL OF CELL SCIENCE   Vol. 129 ( 9 ) page: 1855 - 1865   2016.5

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Cell Science  

    Sustained endoplasmic reticulum (ER) stress disrupts normal cellular homeostasis and leads to the development of many types of human diseases, including metabolic disorders. TAK1 (also known as MAP3K7) is a member of the mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) family and is activated by a diverse set of inflammatory stimuli. Here, we demonstrate that TAK1 regulates ER stress and metabolic signaling through modulation of lipid biogenesis. We found that deletion of Tak1 increased ER volume and facilitated ER-stress tolerance in cultured cells, which was mediated by upregulation of sterol-regulatory-element-binding protein (SREBP)- dependent lipogenesis. In the in vivo setting, central nervous system (CNS)-specific Tak1 deletion upregulated SREBP-target lipogenic genes and blocked ER stress in the hypothalamus. Furthermore, CNS-specific Tak1 deletion prevented ER-stress-induced hypothalamic leptin resistance and hyperphagic obesity under a high-fat diet (HFD). Thus, TAK1 is a crucial regulator of ER stress in vivo, which could be a target for alleviation of ER stress and its associated disease conditions.

    DOI: 10.1242/jcs.180505

    Web of Science

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  23. Chaperone complex BAG2-HSC70 regulates localization of Caenorhabditis elegans leucine-rich repeat kinase LRK-1 to the Golgi Reviewed

    Fukuzono Takashi, Pastuhov Strahil Iv., Fukushima Okinobu, Li Chun, Hattori Ayuna, Iemura Shun-ichiro, Natsume Tohru, Shibuya Hiroshi, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro, Hisamoto Naoki

    GENES TO CELLS   Vol. 21 ( 4 ) page: 311 - 324   2016.4

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Genes to Cells  

    Mutations in LRRK2 are linked to autosomal dominant forms of Parkinson's disease. We identified two human proteins that bind to LRRK2: BAG2 and HSC70, which are known to form a chaperone complex. We characterized the role of their Caenorhabditis elegans homologues, UNC-23 and HSP-1, in the regulation of LRK-1, the sole homologue of human LRRK2. In C. elegans, LRK-1 determines the polarized sorting of synaptic vesicle (SV) proteins to the axons by excluding SV proteins from the dendrite-specific transport machinery in the Golgi. In unc-23 mutants, SV proteins are localized to both presynaptic and dendritic endings in neurons, a phenotype also observed in lrk-1 deletion mutants. Furthermore, we isolated mutations in the hsp-1 gene that can suppress the unc-23, but not the lrk-1 defect. We show that UNC-23 determines LRK-1 localization to the Golgi apparatus in cooperation with HSP-1. These results describe a chaperone-dependent mechanism through which LRK-1 localization is regulated. Mutations in LRRK2 gene are linked to autosomal dominant forms of Parkinson's disease. We identified two human proteins that bind to LRRK2 protein: BAG2 and HSC70, which have been known to form a chaperone complex. We also demonstrated that the C. elegans homologs of BAG2 and HSC70 determine the polarized sorting of synaptic vesicle proteins by regulating the localization of LRK-1, the sole homolog of human LRRK2, to the Golgi apparatus.

    DOI: 10.1111/gtc.12338

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  24. [Regulation of intracellular trafficking of the EGF receptor by ROCO family kinase LRRK1]. Invited

    Hanafusa H, Matsumoto K

    Seikagaku. The Journal of Japanese Biochemical Society   Vol. 83 ( 12 ) page: 1127 - 31   2011.12

     More details

    Authorship:Lead author   Language:Japanese  

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  25. Expression of Siamois and Twin in the blastula Chordin/Noggin signaling center is required for brain formation in Xenopus laevis embryos Reviewed International coauthorship

    Ishibashi Hideyuki, Matsumura Noriko, Hanafusa Hiroshi, Matsumoto Kunihiro, De Robertis E. M., Kuroda Hiroki

    MECHANISMS OF DEVELOPMENT   Vol. 125 ( 1-2 ) page: 58 - 66   2008

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)  

    DOI: 10.1016/j.mod.2007.10.005

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  26. Xenopus ILK (integrin-linked kinase) is required for morphogenetic movements during gastrulation Reviewed

    Yasunaga T, Kusakabe M, Yamanaka H, Hanafusa H, Masuyama N, Nishida E

    GENES TO CELLS   Vol. 10 ( 4 ) page: 369 - 379   2005.4

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Genes to Cells  

    It has been suggested that ILK (integrin-linked kinase) participates in integrin- and growth factor-mediated signaling pathways and also functions as a scaffold protein at cell-extracellular matrix (ECM) adhesion sites. As the recently reported ILK knockout mice were found to die at the peri-implantation stage, the stage specific to mammals, little is known about the function of ILK in early developmental processes common to every vertebrate. To address this, we isolated a Xenopus ortholog of ILK (XeILK) and characterized its role in early Xenopus embryogenesis. XeILK was expressed constitutively and ubiquitously throughout the early embryogenesis. Depletion of XeILK with morpholino oligonucleotides (XeILK MO) caused severe defects in blastopore closure and axis elongation without affecting the mesodermal specification. Furthermore, XeILK MO was found to interfere with cell-cell and cell-ECM adhesions in dorsal marginal zone explants and to result in a significant loss of cell-ECM adhesions in activin-treated dissociated animal cap cells. These results thus indicate that XeILK plays an essential role in morphogenetic movements during gastrulation. © Blackwell Publishing Limited.

    DOI: 10.1111/j.1365-2443.2005.00841.x

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  27. JNK functions in the non-canonical Wnt pathway to regulate convergent extension movements in vertebrates Reviewed

    Yamanaka H, Moriguchi T, Masuyama N, Kusakabe M, Hanafusa H, Takada R, Takada S, Nishida E

    EMBO REPORTS   Vol. 3 ( 1 ) page: 69 - 75   2002.1

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:EMBO Reports  

    Recent genetic studies in Drosophila identified a novel non-canonical Wnt pathway, the planar cell polarity (PCP) pathway, that signals via JNK to control epithelial cell polarity in Drosophila. Most recently, a pathway regulating convergent extension movements during gastrulation in vertebrate embryos has been shown to be a vertebrate equivalent of the PCP pathway. However, it is not known whether the JNK pathway functions in this non-canonical Wnt pathway to regulate convergent extension movements in vertebrates. In addition, it is not known whether JNK is in fact activated by Wnt stimulation. Here we show that Wnt5a is capable of activating JNK in cultured cells, and present evidence that the JNK pathway mediates the action of Wnt5a to regulate convergent extension movements in Xenopus. Our results thus demonstrate that the non-canonical Wnt/JNK pathway is conserved in both vertebrate and invertebrate and define that JNK has an activity to regulate morphogenetic cell movements.

    DOI: 10.1093/embo-reports/kvf008

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  28. Xenopus FRS2 is involved in early embryogenesis in cooperation with the Src family kinase Laloo Reviewed

    Kusakabe M, Masuyama N, Hanafusa H, Nishida E

    EMBO REPORTS   Vol. 2 ( 8 ) page: 727 - 735   2001.8

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:EMBO Reports  

    FRS2 has been identified in mammalian cells as a protein that is tyrosine phosphorylated and binds to Grb2 and Shp2 in response to fibroblast growth factor (FGF) or nerve growth factor (NGF) stimulation. But neither its existence in other vertebrate classes or invertebrates nor its function during embryonic development has been defined. Here we have identified and characterized a Xenopus homolog of FRS2 (xFRS2). xFRS2 is tyrosine phosphorylated in early embryos, and overexpression of an unphosphorylatable form of xFRS2 interferes with FGF-dependent mesoderm formation. The Src family kinase Laloo, which was shown to function in FGF signaling during early Xenopus development, binds to xFRS2 and promotes tyrosine phosphorylation of xFRS2. Moreover, xFRS2 and Laloo are shown to bind to Xenopus FGF receptor 1. These results suggest that xFRS2 plays an important role in FGF signaling in cooperation with Laloo during embryonic development.

    DOI: 10.1093/embo-reports/kve152

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  29. Identification of two Smad4 proteins in Xenopus. Their common and distinct properties. Reviewed

    Masuyama N, Hanafusa H, Kusakabe M, Shibuya H, Nishida E

    The Journal of biological chemistry   Vol. 274 ( 17 ) page: 12163 - 70   1999.4

     More details

    Language:English   Publishing type:Research paper (scientific journal)   Publisher:Journal of Biological Chemistry  

    Smad family proteins have been identified as mediators of intracellular signal transduction by the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily. Each member of the pathway-restricted, receptor-activated Smad family cooperates and synergizes with Smad4, called co-Smad, to transduce the signals. Only Smad4 has been shown able to function as a common partner of the various pathway-restricted Smads in mammals. Here we have identified a novel Smad4-like molecule in Xenopus (XSmad4β) as well as a Xenopus homolog of a well established Smad4 (XSmad4α). XSmad4β is 70% identical to XSmad4α in amino acid sequence. Both of the Xenopus Smad4s can cooperate with Smad1 and Smad2, the pathway-restricted Smads specific for bone morphogenetic protein and TGF-β, respectively. However, they show distinct properties in terms of their developmental expression patterns, subcellular localizations, and phosphorylation states. Moreover, XSmad4β, but not XSmad4α, has the potent ability to induce ventralization when microinjected into the dorsal marginal region of the 4-cell stage of the embryos. These results suggest that the two Xenopus Smad4s have overlapping but distinct functions.

    DOI: 10.1074/jbc.274.17.12163

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Research Project for Joint Research, Competitive Funding, etc. 7

  1. メンブレントラフィックにおけるROCOファミリーキナーゼLRRK1の機能解析

    2011.12 - 2012.11

      More details

     LRRK1は1分子内にRas様GTPaseドメインとMAPKKK様キナーゼドメインをもつユニークな蛋白質である。LRRK1のファミリー分子LRRK2が、家族性パーキンソン病原因遺伝子Park8であることが明らかになり、臨床的にも非常に注目を集めている。しかしこれまでLRRK1及びLRRK2の機能や生理的役割に関してはほとんど明らかになっていない。我々はLRRK1の機能を解析する目的で、LRRK1と相互作用する分子を探索した。その結果、上皮成長因子受容体(EGFR)シグナル経路においてアダプター分子として機能するGrb2、Dyneinモーター蛋白質結合分子NudC、Arf/Rho GAPドメインを持つ分子ARAP1などを同定した。これらの分子は全てEGFR細胞内トラフィックに関与することから、EGFRシグナルに注目しLRRK1の機能解析を行った。その結果これまでに、(1)LRRK1はGrb2を介してEGFRと複合体を形成し、EGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行に必須である事、(2)LRRK1はリソソーム分解経路選別に重要なESCRT(endosomal sorting complex required for transport)複合体と相互作用し、EGFRのエンドソーム内腔小胞陥入に重要な役割を果たす事、(3)LRRK1はNudCを介してDyneinモーター蛋白質と結合する事、を明らかにした。本研究では、(1)LRRK1自身のキナーゼ活性制御機構の解明、(2)LRRK1によるEGFR輸送制御機構の解明、(3)LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御と細胞癌化との関係、について解析を行う。

  2. EGFRシグナルの時空間制御と細胞癌化

    2011.10 - 2012.10

      More details

     過剰なEGFRシグナルや不適切に活性化されたEGFRシグナルは、細胞の癌化を引き起こすことが知られている。実際数多くの癌細胞でEGFRの異常な活性化が報告されている。このことはEGFRシグナルを負に制御する機構が重要であることを示唆している。我々はネガティブフィードバック因子SproutyがFGFRの下流でMAPキナーゼ経路を負に制御することを明らかにしてきたが、EGFRシグナルにおいては、活性化したEGFRのエンドサイトーシスがシグナルの終結に必須であることがわかってきた。LRRK1は、パーキンソン病原因遺伝子LRRK2のファミリー分子であり、臨床的にも非常に注目されているMAPKKK様キナーゼである。しかしこれまでLRRK1及びLRRK2の作用機構および機能に関して、ほとんど明らかになっていない。我々はLRRK1がGrb2を介してEGFRと複合体を形成し、EGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を制御していることを見いだした(Hanafusa et al., Nature Commun. 2 2011)。またLRRK1と相互作用する分子として、Dyneinモータータンパク質結合分子NudCや、微小管プラス端結合分子Clip170を同定した(未発表)。そこで本研究では、(a)LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構の分子メカニズム(特に微小管上のDyneinモータータンパク質依存的な輸送)を明らかにすること、(b)LRRK1によるEGFRシグナルの時空間的制御と細胞癌化との関係を明らかにすること、を目的に研究を進める。

  3. ROCOファミリーキナーゼLRRK1によるEGFRメンブレントラフィック制御

    2010.4 - 2011.3

      More details

     ROCOキナーゼファミリーLRRK1はRas様GTPaseドメインとMAPKKK様キナーゼドメインを持つユニークな分子である。近年ファミリー分子LRRK2がパーキンソン病原因遺伝子(Park8)であることが明らかとなり、臨床的にも注目を集めている。しかしLRRK1及びLRRK2の機能に関してはほとんど明らかになっていない。我々はLRRK1と相互作用する分子を探索した結果、EGFRシグナルで機能するアダプター分子Grb2と、Dyneinモーター蛋白質結合分子NudCを同定した。これまでの解析から、(1)LRRK1はGrb2を介してEGFRの早期-後期エンドソーム移行を制御していること、(2)LRRK1がリソソーム分解経路選別に重要なESCRT複合体と相互作用すること、(3)LRRK1はNudCと結合し、EGFRのDynein依存的な輸送に関与すること、を明らかにしてきた。そこで本申請計画において、LRRK1によるEGFRを含む小胞のDyneinモーター蛋白質依存的な輸送とESCRT複合体によるリソソーム分解経路への選別の協調機構の解明を目指す。

  4. ROCOファミリーキナーゼLRRK1によるEGF受容体シグナルの時空間的制御

    2009.4 - 2010.3

      More details

     本研究では予備的データをもとに、(a)LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構の分子メカニズムを明らかにすること、(b)LRRK1自身の活性化機構を明らかにすること、を目的に研究を進める。(a)に関しては、リソソーム分解経路に重要なESCRT複合体とEGFR/LRRK1複合体との関係の検討や、LRRK1キナーゼの基質の同定を進める。(b)に関しては、LRRK1のキナーゼ活性が自身のGTPaseドメインにより制御されている可能性が高いことから、LRRK1のGEFやGAPの同定を中心に研究を進める。

  5. 新規MAPKKK様キナーゼLRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御

    2009.4 - 2010.3

      More details

     これまで申請者はRas/MAPキナーゼ経路のネガティブフィードバック因子Sproutyの解析から、細胞の増殖/分化にはMAPキナーゼのON/OFFだけでなく、活性化時間が重要であることを明らかにしてきた(Hanafusa et al., Nature Cell Biology, 4 2002; Hanafusa et al., J. Biol. Chem., 279 2004; Hanafusa et al., Nature Cell Biology, 11 2009)。Ras/MAPキナーゼ経路の活性化は細胞のがん化に深く関わっており、このシグナル経路を負に制御する機構は臨床的にも非常に重要である。負に制御する機構として、Sproutyなどインヒビターによる抑制の他に、受容体レベルでのダウンレギュレーション(エンドサイトーシスとそれに続くリソソームでの分解)が重要であることが知られている。最近我々は、新規MAPKKK様キナーゼLRRK1が、EGFRの細胞内トラフィックを制御することで、リソソームにおけるEGFRの分解を制御していることを見いだした。過剰なEGFRシグナルは細胞の癌化を引き起こすことが報告されている。我々はLRRK1がMAPKKK様キナーゼドメインを持つにもかかわらず、EGFRの下流でRas/MAPキナーゼ経路の活性化には関与せず、むしろ活性化したEGFRのダウンレギュレーションを促進することを明らかにした。このことは、MAPKKK様キナーゼが細胞増殖シグナルを負に制御する初めての例である。LRRK1は自身のキナーゼ活性依存的にEGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を制御しており、この制御にESCRT複合体と呼ばれる一群のタンパク質複合体を介した、EGFRのリソソーム経路選別が重要であることを見いだした。しかしこれまで、LRRK1キナーゼの標的タンパク質は同定できておらず、またLRRK1とESCRT複合体との関係の詳細も不明である。そこで本研究課題において、LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構の詳細を明らかにすることで、EGFRシグナルの時空間的制御機構の解明及び細胞癌化機構の解明を試みる。とくにLRRK1キナーゼの標的タンパク質の同定/解析を中心に研究を進める。

  6. EGFR細胞内トラフィック制御と細胞癌化

    2009.4 - 2010.3

    学内共同研究 

      More details

    最近我々は、新規MAPKKK様キナーゼLRRK1が、EGFRの細胞内トラフィックを制御することで、リソソームにおけるEGFRの分解を制御していることを見いだした。過剰なEGFRシグナルは細胞の癌化を引き起こすことが報告されている。我々はLRRK1がMAPKKK様キナーゼドメインを持つにもかかわらず、EGFRの下流でRas/MAPキナーゼ経路の活性化には関与せず、むしろ活性化したEGFRのダウンレギュレーションを促進することを明らかにした。このようにLRRK1によるEGFRシグナルの負の制御は、MAPKKK様キナーゼが細胞増殖シグナルを負に制御する初めての例である。LRRK1は自身のキナーゼ活性依存的にEGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を制御しており、この制御にESCRT複合体と呼ばれる一群のタンパク質複合体を介した、EGFRのリソソーム経路選別が重要であることを見いだした。しかしこれまで、LRRK1キナーゼの標的タンパク質は同定できておらず、またLRRK1とESCRT複合体との関係の詳細も不明である。そこで本研究課題において、LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構の詳細を明らかにすることで、EGFRシグナルの時空間的制御機構の解明及び細胞癌化機構の解明を試みる。

  7. 転写因子XGrhl3によるWntシグナル阻害メカニズムの解析と外胚葉分化

    2006

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KAKENHI (Grants-in-Aid for Scientific Research) 21

  1. メンブレントラフィックによるEGFRシグナルの時空間制御

    Grant number:19H04958  2019.4 - 2021.3

    新学術領域研究(研究領域提案型)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\10530000 ( Direct Cost: \8100000 、 Indirect Cost:\2430000 )

    本研究では以下の3点に焦点を絞り、メンブレントラフィックによるEGFRシグナルの時空間制御機構を明らかにしたい。
    (1)メンブレントラフィックを介したEGFRシグナル制御の数理モデル構築
    (2)ERK活性振動性に対するエンドソームの役割の解明
    (3)小胞体(ER)-エンドソームコンタクトサイトにおけるEGFRシグナル制御機構の解明
    上皮成長因子受容体(EGFR)シグナルは細胞の増殖・分化・遊走に重要であるとともに、その破綻は細胞のガン化に直結する。最近の研究から細胞膜上で活性化したEGFRは、細胞内に取り込まれた後も、エンドソーム膜上からシグナルを発信し続けることが明らかとなってきた。また細胞が晒されるEGF量に応じて、活性化したEGFRの細胞内トラフィックが変化(低濃度のEGF:リサイクル経路、高濃度のEGF:リソソーム分解経路)し、細胞を過剰な刺激から守りつつ、生理的に重要な刺激に対してシグナルを十分に増幅させていることが明らかとなってきた。このようにEGFR細胞内トラフィックは、EGFRシグナルの時空間的制御に重要な役割を果たしている。我々はこれまでROCOファミリーキナーゼLRRK1が、EGFRの細胞内トラフィックを制御することで、EGFRシグナルのダウンレギュレーションに重要なことを明らかにしてきた。そこでLRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御に焦点を絞り、メンブレントラフィックによるEGFRシグナル制御の数理モデルを構築する。昨年度の研究から、細胞が高濃度のEGFに晒された際、リサイクル経路ではなくリソソーム分解経路に選別されるのにLRRK1が重要なことを見出した。EGFRのユビキチン化は、ESCRT複合体によるエンドソーム内腔への取り込みおよびリソソームへの移動に重要なことが知られている。高濃度のEGF刺激で、EGFRは効率よくユビキチン化されるが、このユビキチン化されたEGFRとLRRK1が相互作用し、ESCRT複合体による選別に機能する可能性が明らかとなった。さらにEGFRのエンドソーム内腔への取り込みと、リソソームへの輸送が協調して行われるステップにLRRK1が重要な働きをしていることを明らかにした。
    メンブレントラフィックがEGFRシグナルをどのように制御しているのか、LRRK1による制御機構を中心に解析を進めた。その結果、LRRK1が低分子量Gタンパク質Rab7をリン酸化することで、EGFRを含むエンドソームの微小管上の輸送を促進することを明らかにした。同時にLRRK1は、ユビキチン化されたEGFRとESCRT複合体との結合促進や、フォスファターゼPTP1BによるEGFRの脱リン酸化を促進し、EGFRをリサイクル経路からリソソーム分解経路へと選別するのに機能していることを明らかにした。このようにEGFRシグナルの時空間制御における分子基盤の解明は、期待以上に進んでいる。一方で、これらのデータを基にした数理モデルの構築については、LRRK1抗体が内在性LRRK1の細胞内挙動や発現量を検出するのに十分な感度でないことなどから、パラメーター取得のための情報が十分でなく、思うように進んでいない。これらの状況を踏まえ、総合的にみて概ね順調に進んでいると思われる。
    今後はメンブレントラフィックによるEGFRシグナル制御機構のさらなる解明と、数理モデルへの適応を目指す。具体的には、LRRK1によるEGFRリソソーム分解経路選別について、小胞体上のPTP1Bが、コンタクトサイトを介してエンドソーム上のEGFRを脱リン酸化する機能を明らかにする。これまでPTP1BによるEGFRの脱リン酸化、シグナルダウンレギュレーション及びエンドソーム内腔への取り込みは、明らかとなってきたが、興味深いことにPTP1Bは、LRRK1自体も脱リン酸化していることを見出した。PTP1BによるLRRK1の脱リン酸化は、LRRK1のキナーゼ活性上昇とリンクしており、この制御機構の解明も進める。さらにエンドソーム上のマイクロドメインに、EGFRを集積するステップについても解析する。数理モデルに関しては、引き続き、LRRK1などの内在性タンパク量の測定や、EGF刺激後どのようなタイムコースでエンドソーム局在が変化していくのか計測し、モデル作成に必要なパラメーターの取得を目指す。

  2. ROCOファミリーキナーゼLRRK1/2によるメンブレントラフィック制御の解明

    Grant number:18H02612  2018.4 - 2021.3

    科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\17420000 ( Direct Cost: \13400000 、 Indirect Cost:\4020000 )

    メンブレントラフィックは細胞内で物流網を形成し、環境に応じた適切な細胞応答を可能にしている。我々はこれまでROCOファミリーキナーゼLRRK1が、上皮成 長因子(EGF)受容体を含むエンドソームの輸送・成熟を制御することを明らかにしてきた。一方ファミリー分子LRRK2は、家族性パーキンソン病原因遺伝子とし て同定され、その後の解析からメンブレントラフィックやオートファジーに機能していることが報告されてきた。しかしその作用機構は未だよくわかっていな い。最近我々は、LRRK1の基質としてRab7を同定した。またLRRK2も、Rab8、10、12などRabファミリーを基質とすることが報告されえた。興味深いことにLRRK1/2はRabファミリー間で保存されたセリン・スレオニンをリン酸化し、Rabとエフェクター分子との結合を制御していることが明らかとなってきた。
    そこで本研究課題では、Rabを介したエンドソームとオートファゴソームの成熟機構に注目し、LRRK1/2によるメンブレントラフィック制御を明らかにすべく研究を行った。 昨年度までの研究から、LRRK1がEGFR細胞内輸送においてRab7をリン酸化し、EGFRを含むエンドソームのリソソームへの輸送を促進していることを明らかにした。さらにParkin依存的なマイトファジーにおいて、LRRK1がRab7をリン酸化し、損傷ミトコンドリアの除去に重要なことも明らかにした。
    昨年度に引き続き、LRRK1にフォーカスを当て研究を遂行した。その結果、LRRK1がRab7をリン酸化し、そのエフェクター分子RILPとの結合を促進し、Dynein依存的な輸送を促進することを明らかにした。またLRRK1が、Parkin依存的なマイトファジー(損傷ミトコンドリアを除去する選択的オー トファジー)時に、Rab7をリン酸化し、損傷ミトコンドリアの除去に必須であることを見出した。LRRK1は、オートファジー開始キナーゼULK1の下流で活性化し、Rab7のリン酸化を介してマイトファゴソーム形成に機能していることを明らかにした。最近、LRRK2がRab10をリン酸化することで、マイトファジーを負に制御していることが報告された。LRRK1とLRRK2は、Parkin依存的なマイトファジーの進行において、それぞれ反対の役割(LRRK1がpositive regulatorでLRRK2がnegative regulator)を果たしている可能性が明らかとなってきた。以上の結果を踏まえ、本研究課題は概ね順調に進展していると考えている。
    今後は以下の点に関し研究を行っていく。
    (1)LRRK1によるメンブレントラフィック制御:我々はLRRK1が、EGFRのエンドソーム内腔への取り込みにも機能し、EGFRシグナルをダウンレギュレーションしていることを明らかにしている。そこでメンブレントラフィックとシグナル伝達との協調機構について、LRRK1と相互作用する分子を中心に解析を進める。これまでLRRK1と結合する分子として、チロシンフォスファターゼを同定しており、今後は、このフォスファターゼとの関係について解析を行う。また、SplitGFPを用いた解析から、小胞体―エンドソームコンタクトサイトにおけるLRRK1の機能を明らかにする。
    (2)LRRK1/2によるマイトファジー制御:LRRK1によるParkin依存的なマイトファジー制御機構について、その分子機構を明らかにする。これまでLRRK1のキナーゼ活性がマイトファジーに重要なことを明らかにしているが、マイトファジー時に、LRRK1がどのように活性化するのか検討する。特に、ULK1複合体との関係にフォーカスし解析を行う。

  3. エンドソームを起点とするシグナル発信機構の解明

    Grant number:17H06001  2017.4 - 2019.3

    新学術領域研究(研究領域提案型)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\11700000 ( Direct Cost: \9000000 、 Indirect Cost:\2700000 )

    刺激により細胞膜上で活性化した受容体チロシンキナーゼ(RTK)は、エンドサイトーシスによってエンドソームに集積し、リソソームへと運ばれ分解される。この時、受容体の一部は細胞膜にリサイクルされ、リソソームによる分解を免れる。最近の研究から、同じ活性化した受容体が細胞膜とエンドソームからとで異なるシグナルを発信し、異なった細胞応答を引き起こすことが明らかとなってきた。我々は、RTKの1つ上皮成長因子受容体(EGFR)に注目し、エンドソームを起点とするEGFRシグナルの制御機構の解明を目指している。昨年度までの解析から、ROCOファミリーキナーゼLRRK1が、小胞体(ER)-エンドソームコンタクトサイト上で、EGFRの脱リン酸化・不活性化に重要なことを明らかにした。SplitGFPを用いてコンタクトサイトを可視化し、LRRK1がコンタクトサイト形成に重要か検討したところ、LRRK1はコンタクトサイト形成自体には必要ないことが明らかとなった。一方LRRK1は、コンタクトサイト上でEGFRの脱リン酸化を促進し、EGFRのエンドソーム内腔への取り込みを促進することを明らかにした。LRRK1によるEGFR脱リン酸化およびエンドソーム内腔への取り込みは、エンドソーム膜上から発信されるEGFRシグナルを負に制御していることを明らかにした。
    平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
    平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

  4. Regulation of retrograde transport mediated by LRRK1-Dynein complex

    Grant number:15H04697  2015.4 - 2018.3

    Hanafusa Hiroshi

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\17420000 ( Direct Cost: \13400000 、 Indirect Cost:\4020000 )

    From this study, we revealed that (1) LRRK1 functions to initiate the transport of EGFR-containing endosom along microtubules through the phosphorylation of a microtubule plus end-binding factor CLIP-170 and the promotion of its binding to p150Glued. Furthermore, we revealed that (2) LRRK1 phosphorylates Ser-72 located in the SwitchII region of Rab7 and selectively promotes the binding between Rab7 and RILP. In addition, we revealed that (3) LRRK1 was activated in the M-phase centrosome and phosphorylates the centrosome component CDK5RAP2. This functions in the regulation of spindle orientation by promoting g-tubulin-dependent microtubule nucleation.

  5. Analysis of the licensing mechanism of centriole duplication by using Separase Sensor

    Grant number:15K14508  2015.4 - 2018.3

    Hanafusa Hiroshi

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\3900000 ( Direct Cost: \3000000 、 Indirect Cost:\900000 )

    The centrosome consists of a pair of mother-daughter centrioles, which are replicated only once per cell cycle. At this time, the disengagement of mother-daughter centrioles acts as a licensing signal for centriole duplication. Dissociation of the mother-daughter centrioles occurs by the cleavage of cohesin by the protease separator. When a separator sensor with a chromophore on both sides of the cohesin cleavage sequence is used, the activity of the separase can be observed with a change in fluorescence. In this study, we used this system to identify genes important for licensing signals and analyze their molecular mechanisms. As a result, it was revealed that the ROCO family kinase LRRK1 controls the disengagement of the mother-daughter centrioles in a kinase activity-dependent manner.

  6. LRRK1による中心体複製及びシリアdisassembly制御機構の解析

    Grant number:15H01208  2015.4 - 2017.3

    新学術領域研究(研究領域提案型)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\6500000 ( Direct Cost: \5000000 、 Indirect Cost:\1500000 )

    ROCOファミリーキナーゼLRRK1はRas様GTPaseドメインとMAPKKK様キナーゼドメインを持つユニークな分子である。近年LRRK1のファミリー分 子LRRK2が、家族性パーキンソン病原因遺伝子(Park8)であることが明らかとなり、臨床的にも注目を集めている。しかしLRRK1及びLRRK2の生 理的機能に関してはほとんど明らかになっていなかった。申請者らはLRRK1が活性化したEGFRと複合体を形成し、キナーゼ活性依存的 にEGFR細胞内トラフィックを制御することを明らかにした。さらに最近、LRRK1が中心体においてPLK1-CDK1によってリン酸化・活性化され、 中心体機能に重要な役割を果たしていることを明らかにした。細胞周期間期の中心体は、一次繊毛(Primary cilia)の形成に重要なことが知られている。我々はLRRK1が、キナーゼ活性依存的にシリア形成を制御することを見出した。そこでLRRK1がどのように、シリアの形成・退縮を制御しているのか検討を行った。これまでの研究から、(1)LRRK1は間期の母中心小体で活性化し、ダイニン結合分子NDEL1をリン酸化すること、(2)LRRK1をノックダウンしたRPE1細胞ではシリアの退縮が阻害されることを明らかにした。また質量分析を用いた解析から、LRRK1によるNDEL1のリン酸化候補部位を複数同定することに成 功した。最近NDEL1がシリア退縮に重要であるとの報告がなされた。実際我々はLRRK1がNDEL1のリン酸化を介して、シリアの退縮を制御していることを明らかにした。
    28年度が最終年度であるため、記入しない。
    28年度が最終年度であるため、記入しない。

  7. LRRK1による中心体複製サイクル/シリア伸長制御機構の解析

    Grant number:25113512  2013.4 - 2015.3

    新学術領域研究(研究領域提案型)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\7020000 ( Direct Cost: \5400000 、 Indirect Cost:\1620000 )

    ROCOファミリーキナーゼLRRK1はRas様GTPaseドメインとMAPKKK様キナーゼドメインを持つ分子量240kDaの巨大な分子である。近年ファミリー分子LRRK2がパーキンソン病原因遺伝子(Park8)であることが明らかとなり、臨床的にも注目を集めている。しかしLRRK1及びLRRK2の生理的機能に関してはあまりよくわかっていない。
    申請者らはLRRK1が活性化したEGFRと複合体を形成し、キナーゼ活性依存的にEGFR細胞内トラフィック(早期エンドソームから後期エンドソームへの移行)を制御することを明らかにした(Nat. Commun. 2011, MBC 2012, JCS 2015)。また最近、LRRK1は中心体に局在し、M期中心体で活性化し、中心体の微小管形成活性に重要なことを見出した。M期中心体はスピンドル微小管の極として染色体分離などに機能している事が知られている。一方、間期中心体はG1/G0期シリア形成に重要である。そこで、シリア形成におけるLRRK1の機能を解析したところ、RPE1細胞でLRRK1をノックダウンするとシリアがectopicに形成されることを明らかにした。シリアは細胞がG0期からS期に再進行する際、退縮(disassembly)する必要がある。我々はLRRK1をノックダウンした細胞では、シリアのdisassemblyが阻害され、G0期からS期への再進行がおこらずG0アレストすることを明らかにした。このようにLRRK1は、細胞周期においてM期及びG1/G0期中心体で重要な機能を果たしている事を明らかにした。
    26年度が最終年度であるため、記入しない。
    26年度が最終年度であるため、記入しない。

  8. Analysis of the regulation of asymmetric cell division by using the artificially induced polarization of HeLa cells.

    Grant number:24657088  2012.4 - 2014.3

    HANAFUSA Hiroshi

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\4160000 ( Direct Cost: \3200000 、 Indirect Cost:\960000 )

    Asymmetric cell division is an important mechanism that regulates growth or differentiation of stem cells. In this project, we tried to reveal the role of important factors in asymmetric cell division by using the artificially induced polarization of HeLa cells, in which expressed the chimera molecules between Echinoid, an cell-cell adhesion molecule, and a factor, which activates the polarization signal pathway. We found that ROCO family kinase LRRK1 plays an important role in the control of the axis of cell division by regulating the mitotic spindle.

  9. Analysis of the spatiotemporal regulation of EGFR signal by LRRK1

    Grant number:23687030  2011.11 - 2014.3

    HIROSHI Hanafusa

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\11180000 ( Direct Cost: \8600000 、 Indirect Cost:\2580000 )

    Excess signal from EGFR leads to tumorigenesis. We reveal that LRRK1 regulates EGFR signal spatiotemporally through the regulation of intracellular trafficking of EGFR. Our findings indicate that (1) LRRK1 regulates EGFR transport from early to late endosomes, and (2) LRRK1 regulates efficient sorting of EGFR to the inner vesicles of endosome by interacting with STAM1, a component of ESCRT-0 complex. Furthermore, LRRK1 plays an important role in the initiation of EGFR trafficking by phosphorylating CLIP-170.

  10. LRRK1によるEGFRリソソーム分解経路選別機構の解析

    Grant number:23113713  2011.4 - 2013.3

    新学術領域研究(研究領域提案型)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\6500000 ( Direct Cost: \5000000 、 Indirect Cost:\1500000 )

    ROCOファミリーキナーゼLRRK1はRasに似たGTPaseドメインとMAPKKKに似たキナーゼドメインを持つユニークな分子である。これまで我々は、LRRK1がキナーゼ活性依存的に、EGFRの細胞内トラフィックを制御することを明らかにしてきた。LRRK1はEGF刺激依存的にEGFRと複合体を形成し、EGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を制御する。生細胞を用いたタイムラプス観察から、LRRK1によるEGFRの輸送制御は微小管上をDyneinモータータンパク質依存的に行われることを明らかにした。この輸送制御にはLRRK1のキナーゼ活性が重要な働きをしており、恒常的に活性化させたLRRK1を発現させると、EGFRの輸送が過剰に促進されることを見いだした。その結果、EGFRを含むエンドソームでは早期エンドソームから後期エンドソームへの成熟が異常となり、核付近に肥大化した未成熟でミックスされた小胞を形成する。さらに我々はLRRK1の基質として、微小管プラス端結合因子CLIP-170を同定した。質量分析によりLRRK1がリン酸化する部位を同定したところ、LRRK1はCLIP170のC末のアミノ酸を複数リン酸化し、CLIP-170とp150Gluedとの結合を制御していることが明らかとなった。LRRK1によるCLIP-170のリン酸化は、EGFRを含む早期エンドソームの微小管上輸送の開始に重要である可能性が考えられ、今後その分子メカニズムを解析していく予定である。
    24年度が最終年度であるため、記入しない。
    24年度が最終年度であるため、記入しない。

  11. ROCOファミリー分子LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構の解析

    Grant number:21113509  2009 - 2010

    新学術領域研究(研究領域提案型)

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator  Grant type:Competitive

    Grant amount:\6240000 ( Direct Cost: \4800000 、 Indirect Cost:\1440000 )

    これまでROCOファミリーキナーゼLRRK1がEGFRの細胞内トラフィックを制御することを明らかにしてきた。LRRK1はEGF刺激依存的にEGFRと複合体を形成し、早期エンドソームに共局在する。ここでLRRK1はキナーゼ活性依存的にEGFRの早期エンドソームから後期エンドソームヘの移行を制御する。昨年度の研究から、LRRK1によるEGFRの輸送制御は微小管上をDyneinモータータンパク質依存的に行われることが明らかとなった。LRRK1はDynein結合分子NudCと結合し、NudCを介してDyneinと相互作用する。NudCをノックダウンした細胞ではLRRK1とDyneinとの結合が減少し、EGFRの微小管上の輸送も顕著に阻害される。さらにLRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御機構を検討したところ、LRRK1はEGFRのリソソーム分解経路選別に重要な複合体、ESCRT複合体と相互作用し、EGFRのエンドソーム内腔への陥入を制御していることを明らかにした。LRRK1はESCRT-0複合体構成因子の一つSTAM1と結合し、STAM1のポリユビキチン化を抑制することでEGFRとSTAM1との結合を促進していた。LRRK1はSTAM1のGATドメインと呼ばれる領域に結合し、STAM1のポリユビキチン化レベルを抑制することでSTAM1を活性型に構造変化させ、その結果、STAM1とEGFRとの結合を促進していた。われわれの研究から、(1)LRRK1がDyneinモータータンパク質を介したEGFRの輸送に機能していること、(2)LRRK1がEGFRとESCRT複合体をつなぐスキャホールドタンパク質として機能し、EGFRのリソソーム分解経路選別を制御していること、が明らかとなった。

  12. Analysis of the molecular mechanism how cells monitor the duration of ERK activity

    Grant number:19770167  2007 - 2008

    HANAFUSA Hiroshi

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\3880000 ( Direct Cost: \3400000 、 Indirect Cost:\480000 )

  13. 転写因子XGrhl3によるWntシグナル阻害メカニズムの解析と外胚葉分化

    Grant number:18055011  2006 - 2007

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\7500000 ( Direct Cost: \7500000 )

    Xenopus初期胚外胚葉において表皮組織は、神経組織と拮抗的に形成されることがしられている。われわれは外胚葉の分化を制御する因子としてXenopus Grainyhead like 3(XGrh13)を同定した。XGrh13はXenopus初期胚予定表皮領域に特異的に発現し、神経胚期には神経板の前方に発現がみられる。外胚葉が表皮と神経に分化する際、BMPシグナルは表皮組織誘導因子として働く。これに対し神経組織が誘導される領域では、ChordinなどBMPアンタゴニストが発現しBMPシグナルを阻害している。このように神経誘導にはBMPシグナルの阻害が必須であることが知られている。これまでの解析から、XGrh13はBMPシグナルの下流で機能し、表皮形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらに興味深いことに、XGrh13がWntシグナルを阻害する活性を持つことを見いだした。本研究課題において我々はXGrh13がどのようにWntシグナルを阻害するのか、その分子メカニズムの解明を試みた。その結果、XGrh13は転写活性化因子としてWntシグナルを阻害因子の発現を誘導し、Wntシグナル細胞内伝達因子beta-cateninのレベルでWntシグナル阻害することを明らかにした。さらにXGrh13によって誘導される阻害因子の同定を、cDNAマイクロアレイを用いておこなったところ、mRNA decayに関与する因子XTTPの同定に成功した。XTTPはmRNA結合能依存的にWntシグナルを阻害することがわかった。これらの結果から、XGrh13はWntシグナルをmRNAのレベルで抑制している可能性が考えられ、現在その解析を進めている。

  14. ERK活性化時間をモニターする細胞内分子メカニズムの解明

    Grant number:17770142  2005 - 2006

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\3600000 ( Direct Cost: \3600000 )

    アフリカツメガエル初期発生におけるRas/ERK MAPキナーセ経路とSproutyの重要性について検討した。その結果、Sproutyはアフリカツメガエル初期胚においてもERKの活性化時間を制御し、転写因子Fosの安定性を制御することで、中胚葉背腹軸形成に重要な役割をになっていることが明らかとなった。Xenopus Sprouty1及び2はアフリカツメガエル原腸胚期、中胚葉が形成される帯域に発現がみられる。またこの時期ERKの活性化はオーガナイザーが形成される帯域の背側領域(背側中胚葉)のみで強くみられる。我々は優性不能型Sproutyを用いた実験から、Sproutyが腹側中胚葉でERKの活性化を抑制し、背腹軸形成に寄与していることを明らかにした。さらにERKの活性化状態は、早期誘導因子Fosによってモニターされていることも明らかにした。FosはERKによってリン酸化されると安定化・活性化し、下流遺伝子の発現を誘導することが知られている。われわれはFos蛋白質の安定性が、中胚葉の背側と腹側で異なり、Fosの安定化依存的にChordinの発現が上昇することを明らかにした。つまり中胚葉形成時、Sproutyは腹側でERKの活性化を抑制し、Fos蛋白質は分解・不活性な状態におかれる。一方背側ではSbroutyは不活性な状態にあり、ERKの強く持続的な活性化が生じる。その結果Fosがリン酸化され安定化・活性化し、下流遺伝子Chordinの発現を誘導する。このようにERKの活性化時間とそれをモニターするFosが、細胞分化に重要な役割を果たすことを初めて個体レベルの系で明らかにした。

  15. 上皮形成を司る転写因子XGRHによるWntシグナル阻害メカニズムの解明

    Grant number:17054016  2005

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\4600000 ( Direct Cost: \4600000 )

    Xenopus初期胚において表皮組織は、神経組織と拮抗的に形成されることがしられている。われわれは外胚葉の分化を制御する因子としてXenopus Grainyhead like 3(XGrhl3)を同定した。XGrhl3はXenopus初期胚予定表皮領域に特異的に発現し、神経胚期には神経板の前方に発現がみられる。外胚葉が表皮と神経に分化する際、BMPシグナルは表皮組織誘導因子として働く。これに対し神経組織が誘導される領域では、ChordinなどBMPアンタゴニストが発現しBMPシグナルを阻害している。このように神経誘導にはBMPシグナルの阻害が必須であることが知られている。Xenopus初期胚における優勢不能型XGrhl3やXGrhl3-MOを用いた解析から、XGrhl3はBMPシグナルの下流で機能し、表皮形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらに興味深いことに、XGrhl3がWntシグナルを阻害する活性を持つことを見いだした。XGrhl3はWntシグナルによる二次軸形成を阻害する一方、内在性XGrhl3をKnockdownした胚では異所的なChordinの発現上昇が見られた。外胚葉予定神経領域におけるChordinの発現はWntシグナルに依存しており、XGrhl3はWntシグナルを阻害することでChordinの発現が予定表皮領域に広がることを防いでいると考えられる。Xenopus初期胚外胚葉は、表皮と神経という二つの組織に分化する。この過程にはBMPシグナルやWntシグナル、FGFシグナルなどいくつかのシグナルがクロストークしながら働いていると考えられる。表皮形成に重要なXGrhl3と、スクリーニングで同定された神経形成に関与する遺伝子群とを有機的に関運付けながら解析することで、神経形成過程のシグナルネットワークが明らかになることを期待している。

  16. 周辺制御因子によるRas/MAPキナーゼ経路の時空間的活性化機構の解析

    Grant number:17014041  2005

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\5300000 ( Direct Cost: \5300000 )

    Ras/MAPキナーゼ経路は活性化のon/offだけでなく、活性化される場所(細胞内局在)、活性化時間(一過的または持続的)もさまざまな因子によって制御されている。これらの制御が破綻すると、細胞は適切な応答能(増殖あるいは分化)を失いガン化する。われわれはネガティブフィードバック因子SproutyがERK MAPキナーゼの活性化時間を制御していることを明らかにしてきた。本研究ではさらにERKの活性化を制御する因子Rassf6(Ras association domain family 6)を同定し、その解析を進めた。Rassf6のファミリー分子Rassf1やRassf2がガン抑制遺伝子と考えられていることから、Rassf6もガン化メカニズムに関与する可能性が考えられた。培養細胞を用いた解析から、Rassf6はRas結合ドメインをもち、実際に活性型(GTP結合型)のH-Rasと結合することがわかった。Rassf6はFGF刺激によるERKの活性化を正に制御することが示され、Rasとの結合をとおしてこの経路の制御に重要な役割をはたすことが示唆された。またRassf6と相互作用する因子を酵母Two-hybrid法スクリーニングにより探索した結果、STE-20様キナーゼMST1が同定された。MST1はCaspaseによって活性化されアポトーシスに関与することが知られている。またこれまでの研究からRassf1がMST1と結合しアポトーシスを促進していることも報告されている。現在我々はRassf6がMST1とRasをリンクさせることで細胞ガン化、アポトーシスに重要な働きをしていないか検討しているところである。

  17. Xenopus初期胚におけるERK経路の活性化時間に応じた細胞運命決定機構の解析

    Grant number:16027222  2004 - 2005

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\6000000 ( Direct Cost: \6000000 )

    我々はアフリカツメガエルをモデル系に、中胚葉形成、神経組織形成におけるERK経路とそのネガティブフィードバックインヒビターSproutyの機能解析を行っている。アニマルキャップを用いた解析から、xSprouty2は、FGFによるERKの活性化を一過的にするのに対し、優勢不能型xSprouty2はERKの活性化をより持続的にした。原腸胚期にERKは背側領域で強く活性化していることが知られている。そこでSproutyが腹側領城でERKの活性化を抑制しているのではないかと考え、実験を行った。抗リン酸化ERK抗体を用いてウエスタンブロッティングしたところ、優勢不能型xSprouty2により、腹側でも背側同様強く持続的なERKの活性化が見られるようになった。このことは、原腸胚期Sproutyが腹側領域でERKの活性化を抑制していることを示唆している。またアニマルキャップをアクチビン(Nodalシグナルと同様の効果を持つ)で刺激すると、FGFの誘導を介したERKの活性化がみられる。この時、低濃度のアクチビンではERKの活性化は一過的なのに対し、高濃度のアクチビンではERKの活性化が持続的になることがわかった。さらに優勢不能型xSprouty2存在下で、低濃度のアクチビン刺激を行うと、ERKの活性化は持続的になることも明らかとなった。これらの結果は、Nodalシグナルの下流でSproutyが機能し、ERKの活性化状態の違いを作り出している可能性を示唆している。またXnr1 mRNAによる部分的な二次軸を、優勢不能型MEKが阻害するのに対し、野生型xSprouty2は阻害できなかったことや、ハイレベルなNodalシグナルによる腹側中胚葉の背側化を、野生型xSprouty2は抑制できなかったことから、SproutyはハイレベルなNodalシグナルの下流では阻害活性を持たないと考えている。今後は翻訳後修飾を中心に、背側(ハイレベルなNodalシグナル存在下)でSproutyが不活性な状態にあるのか検討していく予定である。

  18. アフリカツメガエルをモデル系とした体軸形成に重要な遺伝子群の網羅的解析

    Grant number:16011225  2004

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\5300000 ( Direct Cost: \5300000 )

    アフリカツメガエル初期胚は背側決定因子beta-cateninの局在から体軸の形成が始まる。我々はbeta-cateninが直接誘導する遺伝子群を同定することで、体軸形成に重要な遺伝子の網羅的なスクリーニングを試みた。具体的には、8〜16細胞期のアフリカツメガエル初期胚の腹側帯域(ventral marginal zone)に野生型beta-catenin mRNA及び機能喪失型beta-catenin mRNAをそれぞれマイクロインジェクションし、zygoticな転写が始まってすぐのステージ(stage 8.5)までインキュベーションする。Stage 8.5胚に達した後、インジェクションした領域を切り出しtotal RNAを回収した。その後total RNAからcDNAプールを作製、プローブ化した後、サブトラクティブスクリーニングを行なった。予備段階の実験からbeta-cateninによって誘導される事が知られている既知の遺伝子Siamois、Chordinなどが単離され、スクリーニングがうまく機能していることが明かとなった。6000クローンのcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、オーガナイザー形成に重要である事が知られている遺伝子がいくつか同定され、それとともに機能の明らかで無い遺伝子もいくつか同定できた。それらの中にはショウジョウバエの初期発生に重要であると考えられている転写因子なども含まれており、現在アフリカツメガエル初期胚を用いて機能を解析中である。これまでXenopusではゲノム解読が遅れていたせいもあり、網羅的にスクリーニングする手段(cDNAマイクロアレイなど)に制約があった。しかし最近cDNAマイクロアレイの利用が可能となり、アフィメトリクス社製GeneChipを用いた解析から約14400転写産物に対し網羅的にスクリーニングを行なった。その結果サブトラクティブスクリーニングで取りこぼしていた遺伝子が多数単離できた。現在これらの遺伝子に関しモルフォリノアンチセンスオリゴをもちいたknockdownアッセイを行なっている。

  19. Xenopusをモデル動物としたSproutyによるネガティブフィードバック機構

    Grant number:15770109  2003 - 2004

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\3600000 ( Direct Cost: \3600000 )

    我々はアフリカツメガエルXenopusをモデル動物に初期発生におけるシグナル伝達機構の解析を行なっている。これまで哺乳類培養細胞の系を用いた研究から、Ras/ERK経路のネガティブフィードバック制御因子SproutyがERKの活性化時間をコントロールしていることを明らかにしてきた。SproutyはRas/ERK経路を活性化する成長因子(FGFなど)によってチロシンリン酸化され活性化する。リン酸化したSproutyはGrb2と結合することでRas/ERK経路を負に制御していると考えられる。培養細胞で得られた知見(SproutyによるERKの活性化時間のコントロール)が、個体レベルでも存在するのかどうか、アフリカツメガエル初期胚を用いて検討した。まず初めにアフリカツメガエル初期胚においてSproutyがどのような領域で発現しているのか検討した。その結果Sproutyは原腸胚において中胚葉が形成される領域にERKの活性化領域と重複するように発現がみられた。このことはアフリカツメガエル初期胚においてもSproutyがERKの活性化を制御している可能性を示唆していた。次にアニマルキャップアッセイを用い、中胚葉遺伝子の発現に対するSproutyの効果を調べたところ、野生型Sproutyを発現させるとFGF刺激によるERKの活性化を一過的に抑制し、FGF刺激による背側中胚葉遺伝子Chordinの発現を抑制した。これに対し、優勢不能型Sproutyを発現させるとERKの活性化を持続的にし、Chordinの誘導を促進した。実際に初期胚においては、ERKの持続的な活性化はChordinの発現する背側中胚葉でのみ観察され、恐らくSproutyは腹側中胚葉でERKの活性化を負に制御していることが考えられる。さらにERK経路の重要性を検討する為、ERK2に対するmorpholino antisense oligoを作製し内在性のERK2をknockdownさせた。するとこれまで考えられてこなかった頭部構造の欠失という表現型が得られた。現在SproutyによるERKの活性化時問の制御と細胞の運命決定のメカニズムについてより詳細に検討している。

  20. Ras/MAPキナーゼ経路の阻害因子Sproutyの活性制御機構の解析

    Grant number:15024232  2003

    花房 洋

      More details

    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\4200000 ( Direct Cost: \4200000 )

    Ras/MAPキナーゼ経路は細胞の分化/増殖に重要な役割を果たしており、この経路の過剰な活性化は細胞の癌化へとつながる。ネガティブフィードバック機構は、いったん活性化したRas/MAPキナーゼ経路をすみやかに不活性化し、細胞がホメオスタシスを維持するのに重要な役割を果たしている。我々はRas/MAPキナーゼ経路のネガティブフィードバックインヒビターSproutyが、ERK/MAキナーゼを不活性化する分子メカニズムを研究してきた。その過程でSprouty自身がチロシンリン酸化され阻害活性を持つ事を明らかにし、またこのリン酸化は時間依存的におこる事を見い出した。このことは、Sproutyを脱リン酸化するフォスファターゼが存在することを示唆する。Ras/MAPキナーゼ経路を制御するフォスファターゼを解析する過程で、SH2ドメインを持つチロシンフォスファターゼShp2が、Sproutyを直接脱リン酸化することを見い出した。さらにShp2はSproutyを脱リン酸化し、SproutyをGrb2/Sos複合体から解離させることでSproutyの阻害活性を負に制御していることも明かとなった。Shp2はこれまでの研究からフォスファターゼであるにも関わらず、Ras/MAPキナーゼ経路にポジティブに機能することが知られていた。今回我々の研究から、Shp2はSproutyの阻害活性に重要なチロシンリン酸化を脱リン酸化し、Sproutyによる負の制御を解除することでRas/MAPキナーゼ経路にたいしポジティブに働く事が示唆された。

  21. アフリカツメガエルをモデル系とした体軸形成に重要な遺伝子群の網羅的解析

    Grant number:15011221  2003

    花房 洋

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    Authorship:Principal investigator 

    Grant amount:\4600000 ( Direct Cost: \4600000 )

    アフリカツメガエル初期胚は背側決定因子beta-cateninの局在から体軸の形成が始まる。我々はbeta-cateninが直接誘導する遺伝子群を同定することで、体軸形成に重要な遺伝子の網羅的なスクリーニングを試みた。具体的には、8〜16細胞期のアフリカツメガエル初期胚の腹側帯域(ventral marginal-zone)に野生型beta-catenin mRNA及び機能喪失型beta-catenin mRNAをそれぞれマイクロインジェクションし、zygoticな転写が始まってすぐのステージ(stage 8.5)までインキュベーションする。Stage8.5胚に達した後、インジェクションした領域を切り出しtotal RNAを回収した。その後total RNAからcDNAプールを作製、プローブ化した後、サブトラクティブスクリーニングを行なった。予備段階の実験からbeta-cateninによって誘導される事が知られている既知の遺伝子Siamois、Chordinなどが単離され、スクリーニングがうまく機能していることが明かとなった。6000クローンのcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、オーガナイザー形成に重要である事が知られている遺伝子がいくつか同定され、それとともに機能の明らかで無い遺伝子もいくつか同定できた。それらの中にはショウジョウバエの初期発生に重要であると考えられている転写因子なども含まれており、現在アフリカツメガエル初期胚を用いて機能を解析中である。これまでXenopusではゲノム解読が遅れていたせいもあり、網羅的にスクリーニングする手段(cDNAマイクロアレイなど)に制約があった。しかし最近cDNAマイクロアレイに強い実績を持つアフィメトリクス社が一万以上のcDNAが搭載されたXenopus Gene Chipを商品化し、ようやく他の種同様網羅的な解析が簡便にできるようになった。現在、cDNAマイクロアレイを利用したより広範なスクリーニグを行なっているところである。

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Teaching Experience (On-campus) 2

  1. 基礎生化学I

    2017

  2. 生物学特論XI

    2017