科研費 - 邊見 久
-
研究課題/研究課題番号:23K18109 2023年6月 - 2025年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
邊見 久
担当区分:研究代表者
配分額:6500000円 ( 直接経費:5000000円 、 間接経費:1500000円 )
超好熱菌は特殊な構造の膜脂質を生産し、それにより構成される安定な細胞膜によって極限環境に適応している。本研究では、我々が過去に超好熱性古細菌における生合成経路を解明した延長型膜脂質、および最近生合成酵素が同定された双頭型膜脂質をツールとして用い、モデル生物である大腸菌の細胞膜の特性改変を目指す。具体的には、生合成前駆体の人工的な供給経路の導入などの代謝工学的な手法を用い、超好熱菌の膜脂質を大腸菌に大量生産させ、細胞膜の主成分とすることで、透過性が低く安定な膜を持つ大腸菌細胞が作製できるか検証する。
超好熱性古細菌Aeropyrum pernixに特異的な延長型膜脂質について、近年開発された人工的なイソプレノイド前駆体供給経路であるイソプレノール利用経路を活用した、大腸菌における大量生産系を構築した。最適化の結果、細胞中の全脂質の1割を超えるまで延長型古細菌膜脂質を増産させることに成功した。この延長型古細菌膜脂質大量生産大腸菌株の細胞膜にどのような変化が起きているかを各種検査試薬を用いて検証したところ、対照株と比べて膜透過性がわずかに低下した一方で、膜の流動性については変化がないという結果を得た。大腸菌自体の性質として、培地中に加えた有機溶媒に対する耐性が予備実験では観察されていたため、様々な条件で検査を行ったが、培養条件のわずかな違いなどで結果が異なり、再現性に難があることがわかった。今後、研究方法の再検討を行う必要がある。
常温性のメタン生成古細菌Methanosarcina acetivoransに対し好熱性古細菌由来の膜脂質生合成酵素遺伝子を導入し、発現させることで、同菌には元々存在せず、好熱性古細菌に特有な脂質である大環状古細菌膜脂質、および双頭型膜脂質を合成させることに成功した。これらの膜脂質の生産性や生産比率は導入した遺伝子ごとに異なっており、同酵素の生成物比率の違いが各生物の膜脂質組成を規定している可能性が示唆された。この特異性については、今後の構造機能相関研究の進展も期待される。また、Methanosarcina属のメタン菌は一般的なメタン菌よりも幅広い基質からメタンを生成でき、応用可能性の高い生物である。したがって、これまでに達成された細胞膜中の膜脂質組成の改変によりメタン菌の細胞にどのような影響があるかを、今後明らかにしていく必要がある。
大腸菌における古細菌膜脂質の大量生産系の構築と、それが細胞膜に与える影響の検証に関しては論文投稿の段階まで漕ぎ着けている。しかし、当初予想されていた大腸菌の有機溶媒耐性の向上については、実験結果の再現性に問題があり、実験方法を再設定することを迫られている。一方で、大腸菌での試みと並行して進めてきた、メタン生成古細菌を対象とした細胞膜のエンジニアリング技術「生体膜工学」の開発に関しては、好熱菌特異的な膜脂質である大環状膜脂質や双頭型膜脂質を常温性の古細菌に作らせることに成功するといった成果が順調に得られている。古細菌の遺伝子操作は難易度が高いため、これは大きな成果である。これまでに遺伝子組換えメタン菌から抽出した各種膜脂質の構造決定と定量を進めており、まずは膜脂質組成の改変についてまとめて論文として報告したいと考えている。膜脂質組成の変化がメタン生成古細菌の生体膜や細胞に与える影響についてはこれまでにごく簡単な試験しか行えていないため、今後は各種試験を行うことを予定している。
大環状膜脂質や双頭型膜脂質を生産するようになった組換えMethonosarcina acetivoransについて、まずは各種検査試薬を使った生体膜の特性評価を行う。同時に、同菌自体の表現系に変化がないかを調査する。メタン菌は酸素に感受性であり、生細胞を用いた試験はきわめて困難であるが、嫌気チャンバーを使うことで酸素に触れない状態での染色や顕微観察に挑戦する。さらに、メタン菌での生体膜工学をさらに推し進め、これまでに成功していない種類の膜脂質のM. acetivoransにおける生産に取り組むことで、改変された細胞膜を有する生物のサンプル数を増やしたいと考えている。また、未同定の膜脂質の構造決定を進め、導入した酵素の違いにより、どのような構造の膜脂質が生産されるようになったかの対応を明確にする。各酵素の結晶構造解析もしくは計算科学による構造モデリングを実施し、生成物である膜脂質の構造と酵素の構造の関連性を調べる。可能であれば酵素の構造を改変することにより、目的とする膜脂質を生産するメタン菌の作製に取り組みたい。 -
古細菌型メバロン酸経路への酸素耐性付与によるイソプレノイド発酵生産の高効率化
研究課題/研究課題番号:23H02126 2023年4月 - 2026年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
邊見 久, 伊藤 智和
担当区分:研究代表者
配分額:18980000円 ( 直接経費:14600000円 、 間接経費:4380000円 )
申請者らが最近発見した古細菌型メバロン酸経路は、既知経路と比べてエネルギー低消費型の代謝経路であり、同経路の微生物への導入は、様々な有用物質の発酵生産の強化に役立つと期待されている。しかし同経路には酸素が豊富に供給される条件においてが機能が低下するという弱点が存在し、それは同経路に特異的な酵素の酸素感受性に起因すると予想されている。本研究では酸素供給量の違いにより蓄積する中間体を調べることによって同経路の機能低下の原因を究明し、その原因となっている酵素の発現量を増やす、もしくは同酵素に酸素耐性を付与することで、同経路の応用上の弱点の克服を目指す。
-
イソプレノイド生産に向けた革新的シャーシとなる微生物細胞の創製
研究課題/研究課題番号:20H02899 2020年4月 - 2023年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
邊見 久, 海野 英昭, 伊藤 智和
担当区分:研究代表者
配分額:18070000円 ( 直接経費:13900000円 、 間接経費:4170000円 )
イソプレノイドは自然界最大の天然化合物群であり、その中には膨大な数の有用物質が含まれる。これまでに、微生物による有用イソプレノイドの発酵生産を高効率化する目的で、その前駆体供給経路であるメバロン酸経路を使った代謝工学的な試みがなされてきた。しかし、微生物に対するそれらの代謝経路のエネルギー負荷は大きく、生産量の向上には限界があった。本研究では、最近申請者らが古細菌から見出した、ATP 消費量の少ない「低エネルギー負荷型」メバロン酸経路を大腸菌に導入し、イソプレノイド生産のシャーシ(土台)として広範な目的に利用可能な微生物株の作製を目指すと同時に、同経路を構成する酵素に関する理解を深める。
古細菌および未培養真正細菌より単離した、古細菌型メバロン酸経路を構成する新奇酵素であるホスホメバロン酸脱水酵素(PMDh)およびホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素(AMPD)の酵素学的な解析を進め、いくつかの新たな知見を得た。一例として、真正細菌由来のAMPDが活性を発揮するには、補酵素であるプレニル化FMN(prFMN)による再構成が必要であるが、一般的な古細菌のAMPDが再構成にマンガンイオンを要求するのに対し、真正細菌由来のAMPDはマンガンイオンでは再構成されず、鉄イオンを要求するという特性が見出された。PMDhに関しては、いずれの生物種に由来する酵素であっても酸素存在下ですぐに失活し、応用目的において有利な酸素耐性の高い同酵素を得るには何らかの工夫が必要であると思われた。我々は、同酵素の活性中心に4Fe-4Sクラスターが存在することをEPR解析によって明らかにしており、その酸素感受性がPMDh失活の原因だと推察される。
それらの新奇酵素を含む、古細菌型メバロン酸経路を構成する酵素群を大腸菌に導入し、揮発性テルペン化合物の大量生産系の構築を目指した。大腸菌を嫌気培養した際には、同経路の導入によって明らかにテルペン生産は向上し、ポジティブコントロールに用いた真核生物型メバロン酸経路導入株に匹敵する生産性が観察された。しかし、文献値と比較して明らかにテルペン生産量が低かったため、テルペン生合成系の酵素発現を最適化する必要性があると考えられた。
また、メタン生成古細菌をモデルとし、prFMNの生合成を触媒するprFMN合成酵素と、同酵素にプレニルドナー基質であるジメチルアリルリン酸を供給するNudix hydrolaseを見出し、古細菌型メバロン酸経路の周辺で機能する補酵素の代謝経路とそれに関連する酵素群を同定できたことも成果の1つである。
古細菌型メバロン酸経路の導入により、革新的なイソプレノイド生産のシャーシとなりうる微生物を作製するという最終的な目標については、メバロン酸経路の発現強化によって宿主である大腸菌の生育が悪化するといった現象が起き、今後対応すべき点が多く、現状では目標を達成できているとは言えない。その一方で、古細菌型メバロン酸経路中の新奇酵素の特性評価や、同経路周辺の新奇代謝酵素の発見など、酵素学的な研究は順調に進んでおり、代謝工学的な応用に不可欠な多くの知見が蓄積されつつある。
古細菌型メバロン酸経路を構成する、ホスホメバロ ン酸脱水酵素(PMDh)とホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素(AMPD)という2つの新奇酵素について、反応機構解析とX線結晶構造解析を進める。特に、PMDhの酸素感受性の原因を明らかにし、今後の同経路の応用に活かしていくために、酸素に耐性を示す同酵素を進化分子工学的な手法により作出することを目指す。酸素耐性PMDhの単離には、カロテノイド色素の生産を指標としたコロニースクリーニング系を用いることを予定している。また、AMPDの補酵素であるプレニル化フラビンモノヌクレオチド(prFMN)を合成するprFMN合成酵素について、AMPDとのタンパク質間相互作用などの興味深い性質が明らかにされている。そこでAMPDの活性化機構を検証し、同機構におけるprFMN合成酵素の役割を解明する。
本研究課題の最終目的である古細菌型メバロン酸経路を利用したテルペン化合物の高効率な微生物生産については、古細菌型メバロン酸経路が酸素感受性であることと、テルペン生合成酵素が同システムのボトルネックになっていることが問題点として予想されている。前者については酸素耐性酵素の探索もしくは作出による改善を目指す。後者については、プロモーターの変更などの手段により問題点を改善し、古細菌型メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の効率を正確に評価するとともに、既知の真核生物型メバロン酸経路との比較を行いたい。 -
研究課題/研究課題番号:19H04651 2019年4月 - 2021年3月
科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
邊見 久
担当区分:研究代表者
配分額:7670000円 ( 直接経費:5900000円 、 間接経費:1770000円 )
プレニル基転移反応は、イソプレノイドという自然界で最大の天然化合物群の生合成に関わる酵素反応であり、この反応の生成物を変化させることでイソプレノイドの構造多様性を拡張することが可能となる。最近我々は通常の酵素が受け入れない化合物を基質とするプレニル基転移酵素を見出している。その基質認識機構を解明し、その知見をもとに他の酵素の厳格な基質認識を変化させることで、非天然イソプレノイドの合成を試みる。
各種プレニル基転移酵素を対象として、それらの「緩い」基質特異性の物質生産への応用、およびその特異性の分子機構の解明を目指した研究を実施した。シス型プレニル基転移酵素に関しては、メタン生成古細菌より見出した、基質特異性の緩い同酵素であるMM_0014が、通常の基質であるイソペンテニル二リン酸の4位炭素へのプレニル基転移(C-プレニル化)反応だけでなく、グリセロールなど小分子アルコールの水酸基へのプレニル基転移(O-プレニル化)反応を触媒できることを、X線結晶構造解析や質量分析などにより明らかにした。また、古細菌膜脂質の生合成に関わるプレニル基転移酵素の緩い基質特異性を利用し、天然には存在しないC30という長い炭素鎖を有する古細菌膜脂質アナログの酵素合成、および大腸菌による生産に成功した。その他、近年我々が見出した古細菌型メバロン酸経路の中間体を、野生型および変異型の各種プレニル基転移酵素の基質とする実験も実施した。期待した結果を得ることはできなかったものの、その研究の過程で、同経路に関わる新奇酵素について、いくつかの新しい発見を行うことができた。例えばホスホメバロン酸脱水酵素が、真正細菌由来の近縁酵素に関する報告とは異なり、[4Fe-4S]型の鉄硫黄クラスターを活性中心に保持していることをEPR解析により証明した。また、ホスホトランスアンヒドロメバロン酸脱炭酸酵素がプレニル化フラビンを補酵素とすることを再構成実験により証明した。
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。 -
研究課題/研究課題番号:18K19170 2018年6月 - 2021年3月
科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
邊見 久
担当区分:研究代表者
配分額:6240000円 ( 直接経費:4800000円 、 間接経費:1440000円 )
超好熱性古細菌Aeropyrum pernixの持つ、炭化水素鎖の長いイソプレノイド膜脂質を大腸菌に大量生産させ、その膜の物性を変化させる「細胞膜エンジニアリング」技術の確立を目指して研究を進めた。同時期にA. pernixから新奇なイソプレノイド生合成前駆体供給経路である古細菌型メバロン酸経路を見出したため、イソプレノイドの微生物生産に対する同経路の導入の効果を検討した結果、準嫌気条件で宿主を培養した場合にイソプレノイド生産が向上することが示された。また、A. pernixと他生物の遺伝子を組み合わせて大腸菌に導入することで、より長い炭化水素鎖を持つ非天然型古細菌膜脂質の合成に成功した。
本研究で取り扱った古細菌型メバロン酸経路は、既知のメバロン酸経路と比べ、エネルギー低消費型の代謝経路である。そのため、薬品や工業原料などの有用化合物を多く含むイソプレノイドの微生物生産に同経路を利用することで、宿主から生育に必要なエネルギーを大量に奪うことなく物質生産をさせることが可能になるかもしれない。また、本研究で合成に成功した非天然型古細菌膜脂質は、より厚く安定な細胞膜を構成することが予想される。したがって、大腸菌などの生体膜の性質を変化させて強い微生物を作る「細胞膜エンジニアリング」を今後確立する上で有用なツールとなりうる。 -
イソプレノイドの構造多様性を生み出すイソプレン単位間縮合反応のマシナリー
研究課題/研究課題番号:17H05437 2017年4月 - 2019年3月
科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
邊見 久
担当区分:研究代表者
配分額:7540000円 ( 直接経費:5800000円 、 間接経費:1740000円 )
メタン生成古細菌Methanosarcina mazeiに由来するシス型プレニル二リン酸合成酵素について、主に基質特異性に関する解析を進めた結果、同酵素が通常の基質を用いたC-プレニル化反応に加えて、短鎖アルコールをプレニル基受容体基質としたO-プレニル化反応をも触媒できることを明らかにした。このような広い反応性を示すシス型プレニル二リン酸合成酵素の報告は無く、それを可能にする基質認識機構に興味が持たれた。そこでX線結晶構造解析を実施し、同酵素の立体構造を明らかにすることに成功した。
超好熱性古細菌Aeropyrum pernixは炭素数25のプレニル基を疎水性炭素鎖として有するC25古細菌膜脂質を特異的に生産する。我々はすでに、その生合成に関わるプレニル基転移酵素の遺伝子を同一の大腸菌に導入することで、C25古細菌膜脂質を生産させることに成功している。この系の遺伝子の一部を真正細菌由来のプレニル基転移酵素に入れ替えることにより、天然には存在しない、一部C30の炭素鎖を有する古細菌膜脂質の合成に成功した。
古細菌の比較ゲノム解析を行うことで、過去に見出された複数種類のメバロン酸経路のいずれとも異なる変形メバロン酸経路に関与する候補遺伝子を見出し、組換えタンパク質を用いてその酵素活性を明らかにし、メバロン酸経路への関与を証明した。新奇な代謝中間体であるホスホ-trans-アンヒドロメバロン酸を経由する同経路は、大部分の古細菌に分布していると予想されたため、古細菌型メバロン酸経路と命名した。
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。 -
研究課題/研究課題番号:16K14882 2016年4月 - 2018年3月
科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究
邊見 久, 本山 賢人, 小久保 拓也, 吉田 稜
担当区分:研究代表者
配分額:3770000円 ( 直接経費:2900000円 、 間接経費:870000円 )
アーキアの膜脂質の構造は、バクテリアや真核生物といった他生物の膜脂質とは大きく異なっている。その構造の違いにより、アーキア膜脂質で構成された膜はイオンなどの小分子の透過性が低く、その性質が極限環境におけるアーキアの生育を可能にしていると考えられている。そこで我々はアーキア膜脂質をバクテリアである大腸菌に生産させることで、その細胞膜の強化を図っている。本研究では、アーキア膜脂質の生産量を向上させるために、前駆体生合成経路の大腸菌への導入を実施した。また、膜の強化に対してより高い効果が期待される、超好熱性アーキア特異的な膜脂質の生合成経路を明らかにし、同脂質の大腸菌における生産系を構築した。
-
非メバロン酸経路中間体を基質とするプレニル基転移酵素の探索と高分子合成への応用
2014年4月 - 2016年3月
科学研究費補助金 挑戦的萌芽研究
担当区分:研究代表者
-
新奇アーキア酵素を活用した非天然イソプレノイドの生合成マシナリー
2013年4月 - 2015年3月
科学研究費補助金 新学術領域研究
担当区分:研究代表者
-
代謝工学利用を目指したアーキア由来新奇メバロン酸経路の解明
2011年4月 - 2014年3月
科学研究費補助金 基盤研究(C)
担当区分:研究代表者
-
生合成マシナリーヘのアーキア酵素組み込みによる非天然イソプレノイド化合物の創出
2011年4月 - 2013年3月
科学研究費補助金 新学術領域研究
担当区分:研究代表者
-
イソプレノイド代謝研究におけるアーキアからの新展開
2008年9月 - 2010年3月
科学研究費補助金 若手研究(B)
邊見 久
担当区分:研究代表者
-
アーキアのイソプレノイド脂質代謝―酸化還元反応の視点から―
2006年9月 - 2008年3月
科学研究費補助金 若手研究(B)
邊見 久
担当区分:研究代表者
-
プレニルトランスフェラーゼにおける分子進化経路の解明
2002年9月 - 2004年3月
科学研究費補助金 若手研究(B)
邊見 久
担当区分:研究代表者