科研費 - 秋山　真志

表皮脂質異常・バリア障害・炎症、三位一体の魚鱗癬発症機序解明と現実的治療法の開拓

研究課題/研究課題番号：24K02470  2024年4月 - 2027年3月

科学研究費助成事業  基盤研究(B)

秋山 真志, 室 慶直, 棚橋 華奈, 滝 奉樹, 桃原 真理子

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担当区分：研究代表者 

配分額：18460000円 （ 直接経費：14200000円 、 間接経費：4260000円 ）

本研究では、多数の常染色体劣性先天性魚鱗癬(ARCI)患者と多系統の遺伝子改変魚鱗癬モデルマウス、皮膚炎症誘発マウスを対象に、表皮機能脂質の分析、角層バリア機能の評価、皮膚・血液でのシングルセル解析を含めた遺伝子発現プロファイリングを行う。そのデータから、表皮脂質異常、バリア障害、炎症の鍵となる分子、経路を明らかにする。さらに、表皮脂質異常・角層バリア障害・皮膚炎症の三位一体の病態の核となる分子、経路を特定し、それらを標的としたモデルマウス植皮治療実験により、ARCIの新規治療法を提案する。この新規治療法には、皮膚脂質異常、バリア障害を病因とする炎症性疾患の治療、予防への波及効果が期待される。

魚鱗癬での表皮脂質異常・バリア障害と炎症とのクロストークの解明と新規治療への展開

研究課題/研究課題番号：21H02941  2021年4月 - 2024年3月

秋山 真志

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担当区分：研究代表者 

配分額：17420000円 （ 直接経費：13400000円 、 間接経費：4020000円 ）

自己炎症性皮膚疾患における自然治癒機構の解明

研究課題/研究課題番号：19H03679  2019年4月 - 2022年3月

乃村 俊史

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担当区分：研究分担者 

自己炎症性疾患は自然免疫の異常活性化により発症する難治性の疾患である。本研究では、ある自己炎症性皮膚疾患の病変の一部で遺伝子変異が消失し自然治癒する現象に着目し、このメカニズムを解明することで、新しい治療法の開発につなげることを目指している。具体的には、自己炎症性皮膚疾患で見られるそのNF-κB経路の異常活性化が、体細胞組換えという遺伝子変異修復の仕組みを誘導している可能性を検証する。この分子機構が解明されれば、自己炎症性疾患を体細胞組換え誘導により治療する可能性がある。さらに、他の自己炎症性疾患でも同様に遺伝子変異が消失する自然治癒現象が起こっているか検討する予定である。
本研究は、自己炎症性皮膚疾患におけるrevertant mosaicismの発生機構を解明するものである。Revertant mosaicismとは遺伝性疾患の病変部から病因変異を消失した細胞が発生し、病因変異（＋）と（ー）の細胞がモザイクになった状態のことである。遺伝性疾患における「自然治癒現象」のメカニズムが解明できれば、人為的に病因変異を消失させることで根治的な治療法の開発につながる可能性がある。
本研究では、自己炎症性皮膚疾患患者の皮膚に臨床的・組織学的に自然治癒した部位を同定し、その自然治癒部の表皮を採取してDNAを抽出し網羅的SNP解析を行ったところ、2/3の検体でloss of heterozygosityが検出され、体細胞組換えで治癒していた。相同組換え誘導機構を調べるために、Tet-Onシステムを用いて、標的タンパク質をドキシサイクリン依存性に発現する細胞株（野生型1種、変異型2種）を樹立した。それらの細胞株を用いて、変異タンパク質発現によりDNA二重鎖切断が増加するかγH2AXをwestern blotにて定量し検討したが、直接的な増加は検出されなかった。次に、放射線照射やエトポシド添加によりDNA二重鎖切断を誘導し、その修復の際の相同組換え頻度が増加するか53BP1やRPA2のリン酸化を定量し検討したが、増加は認められなかった。
これらの結果から、変異タンパク質は直接的にDNA二重鎖切断を増加させず、DNA二重鎖切断の修復機構において非相同末端結合よりも相同組換えが選択されやすくなる状況を作るわけではないと結論づけた。
実験に使用する細胞株の樹立が完了し、変異タンパク質がDNA二重鎖切断の直接的な増加や修復経路異常をきたすわけではないことを立証できたため。
今後、変異タンパク質が内因性DNA二重鎖切断の主因であるreplication stress応答にどのように関与しているか解析を進める予定である。また、自己炎症性皮膚疾患全般で相同組換えによるrevertant mosaicismが多発しうるのかどうか、臨床的な側面からも検討を進める予定である。

新たな細胞医薬戦略を目指した体細胞復帰変異発生機序の解析と制御法の開発

研究課題/研究課題番号：18K19540  2018年6月 - 2021年3月

挑戦的研究(萌芽)

秋山 真志

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担当区分：研究代表者 

配分額：6370000円 （ 直接経費：4900000円 、 間接経費：1470000円 ）

本研究では、先天性魚鱗癬の一種であるichthyosis with confetti（IWC）に着目した。この疾患では、異常な高頻度で「体細胞復帰突然変異によるモザイク現象」（revertant somatic mosaicism, RSM）を生じている。RSMを起こした健常組織は、患者本人の細胞からなり、一般に免疫原性が認められない為、細胞医薬として理想的である。IWCでは、原因遺伝子KRT1、KRT10の特定の領域に変異が集中するが、RSMが高頻度に生じる理由は不明である。本研究では、IWCのモデル細胞系とモデル動物系を世界に先駆けて作成し、それらの系を用いて、RSMの分子的機序の解明を目指した。具体的には、以下の二つのプロジェクトを行った。
(1)不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築：KRT1のゲノムサイズは約4.5kbと小さく、in situでの遺伝子操作に極めて適しているため、KRT1変異によるモデル系の作成を行った。KRT1遺伝子にCRISPR-Cas9によるヘテロ接合性遺伝子変異導入を行い、野生型および変異KRT1を有する不死化ケラチノサイトを作成し、それぞれ異なる蛍光蛋白で標識した。これらのIWCモデル細胞をスクリーニング系として、RSMを促進する条件についてのケミカルクスリーニング、DNAストレス、siRNAスクリーニングなどの各種スクリーニングプラットホームの構築を試みた。
(2)薬剤投与により誘導可能なIWCモデルマウスの作成：CRISPR-Cas9によりKrt1-EGFPノックインマウスの作成を行った。表皮特異的CreER発現マウスは購入し、4-OHT誘導性mRFPおよび変異KRT1発現カセットをCRISPR-Cas9によるゲノム編集によりヘテロ接合性に導入したマウスを、上記２種のマウスと掛け合わせることにより、IWC症状を薬剤誘導性に発症するモデルマウスの作成を試みた。
本研究計画では、KRT1遺伝子の変異をCRISPR-Cas9によりヘテロ接合性に導入し、変異KRT1を有する不死化表皮細胞を作成し、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞をスクリーニング系として樹立する計画であった。しかし、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞が、培養条件のためか、予定通りに樹立できず、復帰体細胞変異を促進する条件についてのスクリーニングプラットホームの構築のための事前調査に想定以上の時間を要した。そのため、研究計画全体に、やや遅れを生じた。
今後の研究において、具体的には、以下の二つのプロジェクトを推進する方針である。
(1)不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築：これまでの研究の若干の遅れのため、本研究でのKRT1変異によるモデル細胞系の作成実験の一部が、未施行の状態である。この未施行部分を、令和２年度の前半に行い、KRT1遺伝子にCRISPR-Cas9によるヘテロ接合性遺伝子変異導入を行い、野生型および変異KRT1を有する不死化ケラチノサイトを作成し、それぞれ異なる蛍光蛋白で標識したIWCモデル細胞を完全に樹立する。その細胞をスクリーニング系として、RSMを促進する条件についてのケミカルクスリーニング、DNAストレス、siRNAスクリーニングなどの各種スクリーニングプラットホームを完成させる。
(2)RSM発生の分子機序の解析とRSMの発生を制御しうる低分子化合物の探索：上記モデル細胞系を用いて、種々の条件下でのRSM発生頻度、発生機序を解析する。さらに、低分子化合物ライブラリを用いたスクリーニングにより、RSMの発生を制御しうる低分子化合物を探索する。

表皮脂質の異常による魚鱗癬発症メカニズムの解明と新規治療薬開発への展開

研究課題/研究課題番号：18H02832  2018年4月 - 2021年3月

秋山 真志

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担当区分：研究代表者 

配分額：17420000円 （ 直接経費：13400000円 、 間接経費：4020000円 ）

本研究では、大きく分けて、「常染色体劣性先天性魚鱗癬患者を対象とする病因解明とデータバンク、バイオバンク作成プロジェクト」、「常染色体劣性先天性魚鱗癬の病態解明プロジェクト」、「常染色体劣性先天性魚鱗癬の新規病因治療薬開発プロジェクト」の３つのプロジェクトを実施して来ている。本年度においては、「常染色体劣性先天性魚鱗癬患者を対象とする病因解明とデータバンク、バイオバンク作成プロジェクト」と「常染色体劣性先天性魚鱗癬の病態解明プロジェクト」とを、主に併行して進めたが、「常染色体劣性先天性魚鱗癬の新規病因治療薬開発プロジェクト」についても、一部着手した。具体的な本年度の研究実績の概要は以下である。
１）常染色体劣性先天性魚鱗癬患者を対象とする病因解明とデータバンク、バイオバンク作成プロジェクト：全国的な常染色体劣性先天性魚鱗癬患者の集積と脂質関連病因遺伝子の同定を行い、多数の常染色体劣性先天性魚鱗癬患者臨床情報と病因の遺伝情報（主に脂質関連遺伝子の病因遺伝子変異）を患者レジストリへ登録、データバンクを作成した。集積した常染色体劣性先天性魚鱗癬患者からのDNA、RNA、皮膚組織等の生体試料のバイオバンクも作成した。
２）常染色体劣性先天性魚鱗癬の病態解明プロジェクト：実際の常染色体劣性先天性魚鱗癬患者の病因遺伝子変異をCRISPR-Cas9によるゲノム編集技術を用いてノックインした真の疾患モデル細胞、モデルマウスを作成した。
３）常染色体劣性先天性魚鱗癬の新規病因治療薬開発プロジェクト：上記の真の常染色体劣性先天性魚鱗癬モデル細胞を用いて、化合物ライブラリーをスクリーニングした。さらに、既存薬ライブラリーについてもドラッグ・リポジショニングを目指してスクリーニングを行った。
平成30年10月、ヒト病因遺伝子変異を有する真の疾患モデル細胞を用いた化合物ライブラリーのスクリーニングを施行する過程で、治療効果についての有効なスクリーニングを行う為には、当初予定していた化合物の種類、濃度では不十分、不適切なことが判明した。この問題を解決するため、有効なスクリーニングに最適な化合物の種類と濃度について改めて調査、検討する必要が生じた。それらの事前調査に想定以上の時間を要したため、研究の進捗にやや遅れを生じている。
今後も引き続き、「常染色体劣性先天性魚鱗癬患者を対象とする病因解明とデータバンク、バイオバンク作成プロジェクト」、「常染色体劣性先天性魚鱗癬の病態解明プロジェクト」、「常染色体劣性先天性魚鱗癬の新規病因治療薬開発プロジェクト」の３つのプロジェクトを並行して進める。具体的な研究の推進方策は以下である。
１）常染色体劣性先天性魚鱗癬患者を対象とする病因解明とデータバンク、バイオバンク作成プロジェクト：引き続き、全国的な常染色体劣性先天性魚鱗癬患者の集積と脂質関連病因遺伝子の同定を行い、多数の常染色体劣性先天性魚鱗癬患者臨床情報と病因の遺伝情報（主に脂質関連遺伝子の病因遺伝子変異）を患者レジストリへ登録、データバンクを作る。初年度に引き続き、集積した常染色体劣性先天性魚鱗癬患者からのDNA、RNA、皮膚組織等の生体試料のバイオバンクを作成する。
２）常染色体劣性先天性魚鱗癬の病態解明プロジェクト：引き続き、実際の常染色体劣性先天性魚鱗癬患者の病因遺伝子変異をCRISPR-Cas9によるゲノム編集技術を用いてノックインした真の疾患モデルマウスを用いて、皮膚の角化障害の評価と表皮脂質分析を施行する。
３）常染色体劣性先天性魚鱗癬の新規病因治療薬開発プロジェクト：これまでに作成した真の常染色体劣性先天性魚鱗癬モデル細胞を用いて、引き続き、化合物ライブラリーをスクリーニングし、魚鱗癬治療薬候補の選定を行う。さらに、既存薬ライブラリーについてもドラッグ・リポジショニングを目指してスクリーニングを進める。

ブドウ球菌の皮膚感染成立に関与する細菌-宿主間相互作用の解明と予防戦略

研究課題/研究課題番号：17H03922  2017年4月 - 2020年3月

西藤 公司

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担当区分：研究分担者 

本研究ではバリア機能が低下した皮膚をブドウ球菌が通過し、皮膚感染症が成立するまでのメカニズムを解明するために以下の研究を行った。
1．表皮角質層の細胞間脂質となるスフィンゴ脂質の合成酵素遺伝子sptlc2を、重層扁平上皮で欠損するコンディショナルノックアウトマウスを作出した。その結果、同マウスでは角質細胞においてsptlc2遺伝子の欠失が認められた。
2．黄色ブドウ球菌が表皮内に侵入するために、特定の細胞壁成分や外毒素が必要となるかを解析した。その結果、protein Aや塩基性リン脂質合成酵素を欠損させたRN4220株を塗布した皮膚では、表皮への好中球遊走が抑制傾向にあることを証明した。
本研究では、皮膚バリア機能に関連するスフィンゴ脂質の合成酵素を重層扁平上皮特異的に欠損したマウスを作出した。イヌ膿皮症やイヌアトピー性皮膚炎では、角質層においてスフィンゴ脂質の発現量が低下していることが知られている。したがってこのマウスは、イヌの再発性膿皮症やアトピー性皮膚炎における病態学的発症機序を解明する目的で有用になると考えられた。
また本研究では、黄色ブドウ球菌が有する特定の細胞壁分子が好中球の表皮内浸潤に影響する可能性を示唆した。黄色ブドウ球菌は好中球により形成された表皮細胞間を通過することから、本研究の成果は黄色ブドウ球菌の経皮侵入機構の一部を説明できるものと考えられた。

モデルマウスと抗体アレイによる網状肢端色素沈着症の包括的病態解明と治療薬開発

研究課題/研究課題番号：17K10240  2017年4月 - 2020年3月

河野 通浩

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担当区分：研究分担者 

遠隔エンハンサーとクロマチンドメインTADsの異常による新規遺伝病発症機序の解明

研究課題/研究課題番号：16K15547  2016年4月 - 2018年3月

秋山 真志

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担当区分：研究代表者 

配分額：3380000円 （ 直接経費：2600000円 、 間接経費：780000円 ）

ABCA12にヘテロ接合性のみに変異を認める道化師様魚鱗癬４症例について全エクソームシークエンス(WES)を行い、3例においてはABCA12のコーディング領域に新規の病原性変異を同定した。残り1例ではWESにてもABCA12の病原性変異を同定できなかった。この家系でABCA12のtopologically associating domainの5M塩基長についてゲノム構造を解析したが、明らかな異常は同定されなかった。ABCA12発現低下との関連が疑われる配列のデータについて、公開されているクロマチン修飾、および、HI-Cデータベースを用いて関連性推定を行ったが、有力な情報は得られなかった。

表皮における脂質メディエーターの役割の解明と角化異常症の新規治療戦略への展開

2015年4月 - 2018年3月

科学研究費補助金  基盤研究(B)

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担当区分：研究代表者 

表皮における脂質メディエーターの役割の解明と角化異常症の新規治療戦略への展開

研究課題/研究課題番号：15H04887  2015年4月 - 2018年3月

秋山 真志

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担当区分：研究代表者 

配分額：17680000円 （ 直接経費：13600000円 、 間接経費：4080000円 ）

本研究計画において、研究代表者らは、遺伝性角化異常症患者家系を集積し、次世代シークエンサーを用いた全エクソーム・シークエンシング、全ゲノム・シークエンシングによる病因遺伝子変異解析を網羅的行い、病因遺伝子を同定し、角化異常症患者データバンクを作成した。
表皮脂質動態と表皮細胞の分化、増殖との関係性の解明を目指し、疾患モデルマウスで、脂質関連分子、脂質メディエーターと表皮細胞の分化とのクロストークを分析した。今回の研究によって得られた結果から、表皮脂質による表皮細胞の分化・角化に対する影響を包括的にまとめ、それらのデータを総括し、実際に臨床応用可能な角化異常症の治療法を検討した。
本研究の成果から、表皮脂質メディエーターと表皮細胞の分化との相互作用が包括的に解明されることは、表皮細胞の細胞生物学における大きなブレイク・スルーである。
また、角化異常症の多くの症例では、脂質関連分子の異常が病因となっている。本研究で表皮細胞の脂質動態が明らかになることにより、多くの角化異常症の発症機序が詳細に解明され、原因療法への手がかりが得られる。今回の成果は、近い将来、角化異常症の患者さんにとって大きな福音となることが期待される。さらに、表皮の脂質動態の是正という治療戦略は、皮膚バリア機能障害によるアトピー・アレルギー性疾患の治療、予防への応用が大いに期待できる。

不活化変異の導入を治療原理とした多変異対応型遺伝子医療の実証的研究

2015年4月 - 2016年3月

科学研究費補助金 

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担当区分：研究代表者 

炎症性皮膚疾患ケラチノサイトにおけるエピゲノミクス異常の動的変化の解析

研究課題/研究課題番号：26461657  2014年4月 - 2018年3月

小川 靖

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担当区分：その他 

本研究は、乾癬の皮膚病変を誘導可能なモデルマウスを用いて、炎症性皮膚疾患におけるケラチノサイトのエピジェネティクス変化の病変形成における意義を検討する事を目指した。Imiquimod塗布乾癬皮膚病変モデルマウスにおいてクロマチン修飾に影響を及ぼす様々な薬剤をモデルマウス系に投与し症状の変化を検討する、リバースケミカルゲノミクス的な方法論を取る事とした。病態の形成を促進するヒストン脱メチル化酵素阻害剤と抑制するリン酸化酵素阻害剤を新たに同定した。

表皮細胞内ロジスティクスとしての脂質輸送システムの分子基盤の解明

2010年4月

科学研究費補助金  挑戦的萌芽研究

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担当区分：研究代表者 

道化師様魚鱗癬の治療のための指針の作成と新規治療戦略の開発

2009年4月

科学研究費補助金  厚生労働科研費補助金（難治性疾患克服研究事業）

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担当区分：研究代表者 

表皮細胞における脂質のATP結合トランスポーターABCA12の構造機能相関の解析

2009年4月

科学研究費補助金  挑戦的萌芽研究

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担当区分：研究代表者 

魚鱗癬に対する新規治療法ならびに胎児療法の開発

2008年4月

科学研究費補助金  基盤研究（B）（一般）

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担当区分：研究代表者 

重症型魚鱗癬の迅速診断法とDNAレベルでの出生前診断新規システムの確立

2007年4月

科学研究費補助金  萌芽研究

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担当区分：研究代表者 

ABCA12遺伝子変異による重症型魚鱗癬に対する新しい治療法の開発

2006年4月

科学研究費補助金  基盤研究（B）（一般）

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担当区分：研究代表者 

毛包バルジ幹細胞への遺伝子導入による常染色体劣性遺伝性魚鱗癬の新規治療戦略の開発

2004年4月

科学研究費補助金  基盤研究（B）（一般）

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担当区分：研究代表者