Updated on 2023/03/30
博士(バイオサイエンス) （ 1998.3 奈良先端科学技術大学院大学 ）
修士(理学) （ 1992.3 神戸大学 ）
Signal Transduction
Phosphorylation
Kinase
Cytoskeleton
Proteomics
Life Science / Molecular biology
Life Science / Pharmacology
Others / Others / Biochemistry
Others / Others / Cell Biology
Regulation of cytoskeleton by small GTPase Rho and its targets.
タンパク質リン酸化酵素とリン酸化シグナルネットワークの解析
Nara Institute of Science and Technology Graduate School, Division of Biological Science
- 1998.3
Country： Japan
Kobe University Graduate School, Division of Natural Science
1990.4 - 1992.3
Country： Japan
Kobe University Faculty of Science
- 1990
Country： Japan
The Japanese Pharmacological Society
日本分子生物学会
日本生化学会
日本細胞生物学会
日本癌学会
Japan Neuroscience Society
DARPP-32/protein phosphatase 1 regulates Rasgrp2 as a novel component of dopamine D1 receptor signaling in striatum.
Kuroiwa M, Shuto T, Nagai T, Amano M, Kaibuchi K, Nairn AC, Nishi A
Neurochemistry international Vol. 162 page： 105438 2023.1
Rho-Kinase/ROCK Phosphorylates PSD-93 Downstream of NMDARs to Orchestrate Synaptic Plasticity.
Hossen E, Funahashi Y, Faruk MO, Ahammad RU, Amano M, Yamada K, Kaibuchi K
International journal of molecular sciences Vol. 24 ( 1 ) 2022.12
Dopamine drives neuronal excitability via KCNQ channel phosphorylation for reward behavior.
Tsuboi D, Otsuka T, Shimomura T, Faruk MO, Yamahashi Y, Amano M, Funahashi Y, Kuroda K, Nishioka T, Kobayashi K, Sano H, Nagai T, Yamada K, Tzingounis AV, Nambu A, Kubo Y, Kawaguchi Y, Kaibuchi K
Cell reports Vol. 40 ( 10 ) page： 111309 2022.9
Rho-Rho-Kinase Regulates Ras-ERK Signaling Through SynGAP1 for Dendritic Spine Morphology.
Wu M, Funahashi Y, Takano T, Hossen E, Ahammad RU, Tsuboi D, Amano M, Yamada K, Kaibuchi K
Neurochemical research Vol. 47 ( 9 ) page： 2757 - 2772 2022.9
Identification of the Kinase-Substrate Recognition Interface between MYPT1 and Rho-Kinase
Amano Mutsuki, Kanazawa Yoko, Kozawa Kei, Kaibuchi Kozo
BIOMOLECULES Vol. 12 ( 2 ) 2022.2
Muscarinic signaling regulates voltage-gated potassium channel KCNQ2 phosphorylation in the nucleus accumbens via protein kinase C for aversive learning.
Faruk MO, Tsuboi D, Yamahashi Y, Funahashi Y, Lin YH, Ahammad RU, Hossen E, Amano M, Nishioka T, Tzingounis AV, Yamada K, Nagai T, Kaibuchi K
Journal of neurochemistry Vol. 160 ( 3 ) page： 325 - 341 2022.2
KANPHOS: A Database of Kinase-Associated Neural Protein Phosphorylation in the Brain
Ahammad Rijwan Uddin, Nishioka Tomoki, Yoshimoto Junichiro, Kannon Takayuki, Amano Mutsuki, Funahashi Yasuhiro, Tsuboi Daisuke, Faruk Md. Omar, Yamahashi Yukie, Yamada Kiyofumi, Nagai Taku, Kaibuchi Kozo
CELLS Vol. 11 ( 1 ) 2022.1
Dynamic subcellular localization and transcription activity of the SRF cofactor MKL2 in the striatum are regulated by MAPK
Ariza Anthony, Funahashi Yasuhiro, Kozawa Sachi, Faruk Md Omar, Nagai Taku, Amano Mutsuki, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY Vol. 157 ( 6 ) page： 1774 - 1788 2021.6
ARHGAP10, which encodes Rho GTPase-activating protein 10, is a novel gene for schizophrenia risk.
Sekiguchi M, Sobue A, Kushima I, Wang C, Arioka Y, Kato H, Kodama A, Kubo H, Ito N, Sawahata M, Hada K, Ikeda R, Shinno M, Mizukoshi C, Tsujimura K, Yoshimi A, Ishizuka K, Takasaki Y, Kimura H, Xing J, Yu Y, Yamamoto M, Okada T, Shishido E, Inada T, Nakatochi M, Takano T, Kuroda K, Amano M, Aleksic B, Yamomoto T, Sakuma T, Aida T, Tanaka K, Hashimoto R, Arai M, Ikeda M, Iwata N, Shimamura T, Nagai T, Nabeshima T, Kaibuchi K, Yamada K, Mori D, Ozaki N
Translational psychiatry Vol. 10 ( 1 ) page： 247 2020.7
Dopamine Receptor Dop1R2 Stabilizes Appetitive Olfactory Memory through the Raf/MAPK Pathway in Drosophila.
Sun H, Nishioka T, Hiramatsu S, Kondo S, Amano M, Kaibuchi K, Ichinose T, Tanimoto H
The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience Vol. 40 ( 14 ) page： 2935 - 2942 2020.4
Protein kinases phosphorylate long disordered regions in intrinsically disordered proteins
Koike Ryotaro, Amano Mutsuki, Kaibuchi Kozo, Ota Motonori
PROTEIN SCIENCE Vol. 29 ( 2 ) page： 564 - 571 2020.2
Phosphorylation of Npas4 by MAPK Regulates Reward-Related Gene Expression and Behaviors
Funahashi Yasuhiro, Ariza Anthony, Emi Ryosuke, Xu Yifan, Shan Wei, Suzuki Ko, Kozawa Sachi, Ahammad Rijwan Uddin, Wu Mengya, Takano Tetsuya, Yura Yoshimitsu, Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Amano Mutsuki, Yamada Kiyofumi, Kaibuchi Kozo
CELL REPORTS Vol. 29 ( 10 ) page： 3235 - + 2019.12
Protein Kinase N Promotes Stress-Induced Cardiac Dysfunction Through Phosphorylation of Myocardin-Related Transcription Factor A and Disruption of Its Interaction With Actin
Sakaguchi Teruhiro, Takefuji Mikito, Wettschureck Nina, Hamaguchi Tomonari, Amano Mutsuki, Kato Katsuhiro, Tsuda Takuma, Eguchi Shunsuke, Ishihama Sohta, Mori Yu, Yura Yoshimitsu, Yoshida Tatsuya, Unno Kazumasa, Okumura Takahiro, Ishii Hideki, Shimizu Yuuki, Bando Yasuko K., Ohashi Koji, Ouchi Noriyuki, Enomoto Atsushi, Offermanns Stefan, Kaibuchi Kozo, Murohara Toyoaki
CIRCULATION Vol. 140 ( 21 ) page： 1737 - 1752 2019.11
Pathological Progression Induced by the Frontotemporal Dementia-Associated R406W Tau Mutation in Patient-Derived iPSCs
Nakamura Mari, Shiozawa Seiji, Tsuboi Daisuke, Amano Mutsuki, Watanabe Hirotaka, Maeda Sumihiro, Kimura Taeko, Yoshimatsu Sho, Kisa Fumihiko, Karch Celeste M., Miyasaka Tomohiro, Takashima Akihiko, Sahara Naruhiko, Hisanaga Shin-ichi, Ikeuchi Takeshi, Kaibuchi Kozo, Okano Hideyuki
STEM CELL REPORTS Vol. 13 ( 4 ) page： 684 - 699 2019.10
Discovery of a key missing signaling between RHOA/RHO-kinase and ras underlying spine enlargement and LTP
Wu M., Funahashi Y., Takano T., Tsuboi D., Ahammad R., Amano M., Kaibuchi K.
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY Vol. 150 page： 121 - 121 2019.7
Comprehensive analysis of kinase-oriented phospho-signaling pathways.
Amano M, Nishioka T, Tsuboi D, Kuroda K, Funahashi Y, Yamahashi Y, Kaibuchi K
Journal of biochemistry Vol. 165 ( 4 ) page： 301 - 307 2019.4
In Vivo Identification of Protein Kinase Substrates by Kinase-Oriented Substrate Screening (KIOSS).
Nishioka T, Amano M, Funahashi Y, Tsuboi D, Yamahashi Y, Kaibuchi K
Current protocols in chemical biology Vol. 11 ( 1 ) page： e60 2019.3
Balance between dopamine and adenosine signals regulates the PKA/Rap1 pathway in striatal medium spiny neurons.
Zhang X, Nagai T, Ahammad RU, Kuroda K, Nakamuta S, Nakano T, Yukinawa N, Funahashi Y, Yamahashi Y, Amano M, Yoshimoto J, Yamada K, Kaibuchi K
Neurochemistry international Vol. 122 page： 8 - 18 2019.1
Targeting Tyro3 ameliorates a model of PGRN-mutant FTLD-TDP via tau-mediated synaptic pathology
Fujita Kyota, Chen Xigui, Homma Hidenori, Tagawa Kazuhiko, Amano Mutsuki, Saito Ayumu, Imoto Seiya, Akatsu Hiroyasu, Hashizume Yoshio, Kaibuchi Kozo, Miyano Satoru, Okazawa Hitoshi
NATURE COMMUNICATIONS Vol. 9 ( 1 ) page： 433 2018.1
Mechanism of dopamine signaling for membrane excitability
Tsuboi D., Shimomura T., Nakano T., Nagai T., Amano M., Yoshimoto J., Kubo Y., Kaibuchi K.
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY Vol. 142 page： 135 - 135 2017.8
Discovery of long-range inhibitory signaling to ensure single axon formation Reviewed
Takano T, Wu M, Nakamuta S, Naoki H, Ishizawa N, Namba T, Watanabe T, Xu C, Hamaguchi T, Yura Y, Amano M, Hahn KM, and Kaibuchi K.
Nat Commun Vol. 8 ( 1 ) page： 33 2017.6
KANPHOS (Kinase-Associated Phospho-Signaling) Platform - A database for neural phosphoproteomics with quality control
Kuroda Keisuke, Nagai Taku, Amano Mutsuki, Yoshimoto Junichiro, Kannon Takayuki, Nishioka Tomoki, Usui Shiro, Kaibuchi Kozo
JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES Vol. 133 ( 3 ) page： S263 - S263 2017.3
A FRET Biosensor for ROCK Based on a Consensus Substrate Sequence Identified by KISS Technology Reviewed
Li C, Imanishi A, Komatsu N, Terai K, Amano M, Kaibuchi K, and Matsuda M.
Cell Struct Funct Vol. 42 ( 1 ) page： 1 - 13 2017.1
A FRET Biosensor for ROCK Based on a Consensus Substrate Sequence Identified by KISS Technology
Li Chunjie, Imanishi Ayako, Komatsu Naoki, Terai Kenta, Amano Mutsuki, Kaibuchi Kozo, Matsuda Michiyuki
CELL STRUCTURE AND FUNCTION Vol. 42 ( 1 ) page： 1 - 13 2017
Identification of Protein Kinase Substrates by the Kinase-Interacting Substrate Screening (KISS) Approach Invited Reviewed
Amano, M. Nishioka, T. Yura, Y. Kaibuchi, K.
Curr Protoc Cell Biol Vol. 72 page： 14 16 1-14 16 12 2016.9
Focused Proteomics Revealed a Novel Rho-kinase Signaling Pathway in the Heart Reviewed
Yura, Y. Amano, M. Takefuji, M. Bando, T. Suzuki, K. Kato, K. Hamaguchi, T. Hasanuzzaman Shohag, M. Takano, T. Funahashi, Y. Nakamuta, S. Kuroda, K. Nishioka, T. Murohara, T. Kaibuchi, K.
Cell Struct Funct Vol. 41 ( 2 ) page： 105-120 2016.8
Phosphoproteomics of the Dopamine Pathway Enables Discovery of Rap1 Activation as a Reward Signal In Vivo Reviewed
Nagai, T. Nakamuta, S. Kuroda, K. Nakauchi, S. Nishioka, T. Takano, T. Zhang, X. Tsuboi, D. Funahashi, Y. Nakano, T. Yoshimoto, J. Kobayashi, K. Uchigashima, M. Watanabe, M. Miura, M. Nishi, A. Kobayashi, K. Yamada, K. Amano, M. Kaibuchi, K.
Neuron Vol. 89 ( 3 ) page： 550-565 2016.2
Single-Cell Memory Regulates a Neural Circuit for Sensory Behavior Reviewed
Kobayashi, K. Nakano, S. Amano, M. Tsuboi, D. Nishioka, T. Ikeda, S. Yokoyama, G. Kaibuchi, K. Mori, I.
Cell Rep Vol. 14 ( 1 ) page： 11-21 2016.1
Developing novel methods to search for substrates of protein kinases such as Rho-kinase Invited Reviewed
Nishioka, T. Shohag, M. H. Amano, M. Kaibuchi, K.
Biochim Biophys Acta Vol. 1854 ( 10 ) page： 1663-1666 2015.10
Phosphoproteomic Analysis Using the WW and FHA Domains as Biological Filters Reviewed
Hasanuzzaman Shohag, M. Nishioka, T. Uddin Ahammad, R. Nakamuta, S. Yura, Y. Hamaguchi, T. Kaibuchi, K. Amano, M.
Cell Struct Funct Vol. 40 ( 2 ) page： 95-104 2015.8
Kinase-interacting substrate screening is a novel method to identify kinase substrates Reviewed
Amano, M., Hamaguchi, T., Shohag, M. H., Kozawa, K., Kato, K., Zhang, X., Yura, Y., Matsuura, Y., Kataoka, C., Nishioka, T., and Kaibuchi, K.
J Cell Biol Vol. 209 ( 6 ) page： 895-912 2015.6
In vivo Screening for Substrates of Protein Kinase A Using a Combination of Proteomic Approaches and Pharmacological Modulation of Kinase Activity. Reviewed
Hamaguchi, T., Nakamuta, S., Funahashi, Y., Takano, T., Nishioka, T., Shohag, M. H., Yura, Y., Kaibuchi, K., and Amano, M.
Cell Struct Funct Vol. 40 page： 1-12 2015.1
Preferential targeting of p39-activated Cdk5 to Rac1-induced lamellipodia. Reviewed
Ito, Y., Asada, A., Kobayashi, H., Takano, T., Sharma, G., Saito, T., Ohta, Y., Amano, M., Kaibuchi, K., and Hisanaga, S.
Mol Cell Neurosci Vol. 61 page： 34-45 2014.6
Distinct distribution and localization of Rho-kinase in mouse epithelial, muscle and neural tissues Reviewed
Iizuka, M., Kimura, K., Wang, S., Kato, K., Amano, M., Kaibuchi, K., Mizoguchi, A.
Cell Struct Funct Vol. 37 ( 2 ) page： 155-175 2012.9
The inositol 5-phosphatase SHIP2 is an effector of RhoA and is involved in cell polarity and migration Reviewed
Kato, K., Yazawa, T., Taki, K., Mori, K., Wang, S., Nishioka, T., Hamaguchi, T., Itoh, T., Takenawa, T., Kataoka, C., Matsuura, Y., Amano, M., Murohara, T., Kaibuchi, K.
Mol Biol Cell Vol. 23 ( 13 ) page： 2593-2604 2012.5
Proteomic screening for Rho-kinase substrates by combining kinase and phosphatase inhibitors with 14-3-3zeta affinity chromatography Reviewed
Nishioka, T., Nakayama, M., Amano, M., Kaibuchi, K.
Cell Struct Funct Vol. 37 ( 1 ) page： 39-48 2012.1
A proteomic approach for comprehensively screening substrates of protein kinases such as Rho-kinase Reviewed
Amano, M., Tsumura, Y., Taki, K., Harada, H., Mori, K., Nishioka, T., Kato, K., Suzuki, T., Nishioka, Y., Iwamatsu, A.,Kaibuchi, K.
PLoS One Vol. 5 ( 1 ) page： e8704 2010
Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity Invited Reviewed
Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K.
Cytoskeleton Vol. 67 ( 9 ) page： 545-54 2010
*Rho-kinase contributes to sustained RhoA activation through phosphorylation of p190A RhoGAP Reviewed
Mori, K.Amano, M.Takefuji, M.Kato, K.Morita, Y.Nishioka, T.Matsuura, Y.Murohara, T.Kaibuchi, K.
J Biol Chem Vol. 284 ( 8 ) page： 5067-5076 2009
Rho-kinase phosphorylates PAR-3 and disrupts PAR complex formation Reviewed
Nakayama, M.Goto, T. M.Sugimoto, M.Nishimura, T.Shinagawa, T.Ohno, S.Amano, M.Kaibuchi, K.
Dev Cell Vol. 14 ( 2 ) page： 205-215 2008
Rho-kinase modulates the function of STEF, a Rac GEF, through its phosphorylation Reviewed
Takefuji, M., Mori, K., Morita, Y., Arimura, N., Nishimura, T., Nakayama, M., Hoshino, M., Iwamatsu, A., Murohara, T., Kaibuchi, K., Amano, M.
Biochem Biophys Res Commun Vol. 355 ( 3 ) page： 788 2007.4
Nuclear Rho kinase, ROCK2, targets p300 acetyltransferase Reviewed
J NeurochemJ Biol Chem Vol. 281 ( 22 ) page： 15320-15329 2006
Molecular mechanism for the regulation of rho-kinase by dimerization and its inhibition by fasudil Reviewed
Structure Vol. 14 ( 3 ) page： 589-600 2006
Regulatory machinery of UNC-33 Ce-CRMP localization in neurites during neuronal development in Caenorhabditis elegans Reviewed
J Neurochem Vol. 95 ( 6 ) page： 1629-1641 2005
Rho-kinase and myosin II activities are required for cell type and environment specific migration Reviewed
Genes Cells Vol. 10 ( 2 ) page： 107-117 2005
Rho mediates endocytosis of epidermal growth factor receptor through phosphorylation of endophilin A1 by Rho-kinase Reviewed
Genes Cells Vol. 10 ( 10 ) page： 973-987 2005
Phosphorylation by Rho kinase regulates CRMP-2 activity in growth cones Reviewed
Mol Cell Biol Vol. 25 ( 22 ) page： 9973-9984 2005
Design and synthesis of Rho kinase inhibitors (I) Reviewed
Bioorg Med Chem Vol. 12 ( 9 ) page： 2115-2137 2004
Interaction of Rho-kinase with myosin II at stress fibres Reviewed
Genes Cells Vol. 9 ( 7 ) page： 653-660 2004
Inflammatory stimuli upregulate Rho-kinase in human coronary vascular smooth muscle cells Reviewed
J Mol Cell Cardiol Vol. 37 ( 2 ) page： 537-546 2004
Entrapment of Rho ADP-ribosylated by Clostridium botulinum C3 exoenzyme in the Rho-GDI-1 complex
J Biol Chem Vol. 278 ( 31 ) page： 28523-28527 2003
Identification of Tau and MAP2 as novel substrates of Rho-kinase and myosin phosphatase Reviewed
J Neurochem Vol. 87 ( 3 ) page： 780-790 2003
Parallel coiled-coil association of the RhoA-binding domain in Rho-kinase Reviewed
J Biol Chem Vol. 278 ( 41 ) page： 46046-46051 2003
Isolation of the interacting molecules with GEX-3 by a novel functional screening Reviewed
Biochem Biophys Res Commun Vol. 292 ( 3 ) page： 697-701 2002
Translocation of Na(+),K(+)-ATPase is induced by Rho small GTPase in renal epithelial cells Reviewed
Biochem Biophys Res Commun Vol. 297 ( 5 ) page： 1231-1237 2002
Rho-kinase-mediated contraction of isolated stress fibers Reviewed
J Cell Biol Vol. 153 ( 3 ) page： 569-584 2001
Arachidonic acid-induced Ca2+ sensitization of smooth muscle contraction through activation of Rho-kinase Reviewed
Pflugers Arch Vol. 441 ( 5 ) page： 596-603 2001
Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of non-muscle cells
Trends Pharmacol Sci Vol. 22 ( 1 ) page： 32-39 2001
CRMP-2 induces axons in cultured hippocampal neurons Reviewed
Nat Neurosci Vol. 4 ( 8 ) page： 781-782 2001
Phosphorylation of ERM proteins at filopodia induced by Cdc42 Reviewed
Genes Cells Vol. 5 ( 7 ) page： 571-581 2000
Regulation and functions of Rho-associated kinase
Exp Cell Res Vol. 261 ( 1 ) page： 44-51 2000
Purification and in vitro activity of Rho-associated kinase Reviewed
Methods Enzymol Vol. 325 page： 149-155 2000
Phosphorylation of Collapsin Response Mediator Protein-2 by Rho-kinase: Evidence for Two Separate Signaling Pathways for Growth Cone Collapse Reviewed
J Biol Chem Vol. 275 ( 31 ) page： 23973-23980 2000
Identification of Calponin as a Novel Substrate of Rho-Kinase Reviewed
Biochem Biophys Res Commun Vol. 273 ( 1 ) page： 110-116 2000
*The COOH terminus of Rho-kinase negatively regulates Rho-kinase activity. Reviewed
J. Biol. Chem. Vol. 274 page： 32418-32424 1999
Phosphorylation of myosin-binding subunit(MBS) of myosin phosphatase by Rho-kinase in vivo.
J. Cell Biol. Vol. 147 page： 1023-1038 1999
Rho-associated kinase of chicken gizzard smooth muscle.
J. Biol. Chem. Vol. 274 page： 3744-3752 1999
Regulation of Cytoskeleton and cell adhesions by the small GTPase Rho and its targets.
Trends in Cardiovascular Medicine Vol. 8 page： 162-168 1998
Rho-kinase phosphorylates COOH-terminal threonines of Ezrin/Radixin/Moesin(ERM)proteins and regulates their Head-to-tail association.
J Cell Biol Vol. 140 page： 647-657 1998
Myosin II activation promotes neurite retraction during the action of Rho and Rho-kinase.
Genes Cells Vol. 3 page： 177-188 1998
Cytoskeletal rearrangements and transcriptional activation of c-fos serum response element by Rho-kinase.
J Biol Chem Vol. 272 page： 26121-25127 1997
*Formation of actin stress fibers and focal adhesions enhanced by Rho-kinase. Reviewed
Science Vol. 275 page： 1308-1311 1997
Phosphorylation of glial fibrillary acidic protein at the same sites by cleavage furrow kinase and Rho-associated kinase.
J Biol Chem Vol. 272 page： 10333-10336 1997
Rho-associated kinase directly induces smooth muscle contraction through myosin light chain phosphorylation.
J Biol Chem Vol. 272 page： 12257-12260 1997
Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase(Rho-kinase). Reviewed
Science Vol. 273 page： 245-248 1996
Rho-associated kinase, a novel serine/threonine kinase, as a putative target for the small GTP-binding protein Rho.
EMBO J Vol. 15 page： 2208-2216 1996
*Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase(Rho-kinase).
J Biol Chem Vol. 271 page： 20246-20249 1996
Identification of a putative target for Rho as a serine-threonine kinase protein Kinase N. Reviewed
Science Vol. 271 page： 648-650 1996
Ｒｈｏファミリーシグナル伝達系分子を対象とした疾患関連遺伝子の探索
2006
Grant number：20K07600 2020.4 - 2023.3
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
渡辺 崇, 柳 久乃, 天野 睦紀, 下野 洋平
Authorship：Coinvestigator(s)
がん幹細胞は自己複製能と多分化能、強い造腫瘍性、治療抵抗性といった特徴を有し、がんの再発や転移の原因とされている。申請者の所属する研究室では、乳がんの手術検体を移植した異種移植(PDX)マウスを作製することで、肝臓に自然転移するがん幹細胞を解析できる実験系を世界に先駆けて樹立した。申請者らは本PDXマウスのがん幹細胞では足場タンパク質S100が高発現しており、転移がん幹細胞ではS100の発現がさらに10倍以上誘導されることを見出した。本研究では、S100による乳がん幹細胞の特性を制御する分子機構、特に機能的リン酸化シグナルに焦点を絞り、乳がん幹細胞を標的とする治療ターゲットを提案する。
当該年度は人工脳腫瘍幹細胞をモデルとし、リン酸化プロテオミクスの手法を用いて脳腫瘍がん幹細胞の多様性と、それを制御する分子機構の解析を行なった。先行研究により人工的に作製した脳腫瘍がん幹細胞は、代謝特性が異なる２つのサブクローン（ATSとBTS）に大別できることが判明している。今回、それらのサブクローンに特徴的なリン酸化タンパク質を14-3-3用いて濃縮し、質量分析によって網羅的に同定した。その結果、ATSあるいはBTSに特徴的にリン酸化が亢進しているタンパク質を見出すことに成功し、脳腫瘍がん幹細胞の不均一がリン酸化シグナルにより制御されていることが示唆された。
得られたリン酸化タンパク質のうち、細胞運動や極性制御に関与することが知られているAktの基質Girdinに焦点を絞り、詳細な解析を進めた。14-3-3が結合するGirdinの
領域をPulldown実験により検討したところ、GirdinのC末端中、1490番目のセリン残基に14-3-3が結合することを見出した。さらに、脳腫瘍がん幹細胞内でのGirdinの機能を解析するため、Girdinの遺伝子発現を抑制したATS, BTSを樹立した。脳腫瘍がん幹細胞の自己複製能と腫瘍形成能をin vitroで検証することができるスフェア形成試験を行なったところ、ATSはGirdin の遺伝子発現抑制により影響を受けないものの、BTSではGirdin の遺伝子発現抑制よりスフェアの形成能が著しく減弱することが明らかになった。また、Girdinの遺伝子発現抑制はATSとBTSの細胞増殖あるいは、代謝特性に大きな影響を与えないことを見出している。
これらのことから、Girdinのリン酸化レベルは脳腫瘍がん幹細胞の不均一性を制御する分子機構の一端であることが示唆された。
がん幹細胞を制御するリン酸化シグナルを解明する目的で、人工脳腫瘍がん幹細胞をモデルとした研究に重点を移行した。昨年まで研究に用いてきた乳がん幹細胞と異なり、人工脳腫瘍がん幹細胞はin vitroで増殖することが可能で、生化学的なアプローチに適していた。その結果、リン酸化プロテオミクスによるリン酸化タンパク質の同定、その制御因子の遺伝子発現抑制による機能解析に成功している。現在は移植実験並びに、網羅的遺伝子発現解析などに研究を展開しており、全体としては概ね順調に進展している。
今年度に同定したGirdinを手がかりとし、人工脳腫瘍がん幹細胞の不均一性を制御するリン酸化シグナルの研究を進める。具体的にはBTS中でGirdinのリン酸化を担うキナーゼの同定を行う。また、Girdin遺伝子発現抑制したがん幹細胞をマウスに移植することによる腫瘍形成能への影響を検討する。さらには、網羅的遺伝子発現解析、１細胞遺伝子発現解析などのバイオインフォマティクス的な手法で研究を展開し、統合的に脳腫瘍がん幹細胞を制御するリン酸化シグナルの解析を行うことで、脳腫瘍がん幹細胞の不均一性を解明し、それを克服できる治療ターゲットを勘案する。
心臓の硬化を制御するG蛋白質共役受容体の機能解明と心不全治療薬シーズの探索
Grant number：20H03674 2020.4 - 2023.3
科学研究費助成事業 基盤研究(B)
竹藤 幹人, 榎本 篤, 室原 豊明, 天野 睦紀
Authorship：Coinvestigator(s)
近年、心臓が硬くなり拡がりにくいために症状を呈する「収縮機能が保たれた心不全（HFpEF）」が注目されている。従来の心収縮機能低下を標的とする治療法ではHFpEFの治療効果は乏しく、HFpEFに対する新たな治療法の開発が求められている。adhesion-GPCRファミリーは物理的刺激により活性化されるGPCRとして新たに分類され、メカノストレスに対する生体反応を制御する分子として注目されている。adhesion-GPCR X がHFpEFに関わっていることを明らかにし、その下流で活性化するリン酸化シグナルを解析する。本研究では、HFpEF治療薬の開発シーズを得ることを目指す。
これまで心不全は、心収縮能が低下する病態とされてきたが、近年、心臓が硬くなり拡がりにくいために症状を呈する「収縮機能が保たれた心不全（HFpEF）」が高齢者特有の心不全として注目されている。従来の心収縮機能低下を標的とする治療法ではHFpEFの治療効果は乏しく、超高齢社会をむかえるなかでHFpEFに対する新たな治療法の開発が求められている。既に加齢および心不全により発現が増加する機能未知のGタンパク質共役受容体（adhesion-GPCR X）を同定し、遺伝子欠損マウスを用いた予備的実験を行い、adhesion-GPCR X の下流で活性化するα-kinase XがHFpEF発症に関わることを見出した。CRISPR/CAS9システムにより、Cre発現依存的α-kinase X欠損マウスを作製した。研究代表者が開発した薬物誘導性心筋特異的Creマウスと交配し、心筋特異的α-kinase X欠損マウスを作製した。
NOS阻害薬(L-NAME)と高脂肪食(HFD)摂取によるHFpEFマウスモデルを用いて、心筋特異的α-kinase X欠損マウスがHFpEFを抑制するかを検討した。心臓超音波を用いてE/AとE/E’により心臓の拡張障害を評価したところ、α-kinase X欠損マウスは拡張障害が悪化したことから、α-kinase XのHFpEFへの関与が示唆された。さらにカテーテル検査にて心臓の拡張能が障害されていることも明らかにした。免疫免職法により心筋組織を評価したところ、心臓間質の線維化の変化は乏しいことから、α-kinase Xは心筋細胞の拡張能を制御していると考えられた。
コロナ感染により研究施設利用や海外からの試薬の取り寄せに制限があった時期があったが、研究自体は進行している。
心筋特異的adhesion-GPCR X欠損マウスに対して、NOS阻害薬(L-NAME)と高脂肪食(HFD)摂取によるHFpEFマウスモデルを用いて、心筋特異的adhesion-GPCR X欠損マウスがHFpEFを抑制するかを検討する。心臓超音波を用いてE/AとE/E’により心臓の拡張障害、カテーテルを用いた心内圧測定による拡張障害の評価、生存率などを明らかにする。Hematoxylin-Eosin染色、Picro-Sirius Red染色、Azan染色、各種特殊染色により、心筋の性状を検討する。原子間力顕微鏡(Core AFM Nanosurf)を用いて心臓の表層および心臓凍結切片を評価する。原子間力顕微鏡は探針と試料表面との間に働く力（弾性率）を検出することにより試料の硬さの評価が可能であり、adhesion-GPCR X 欠損マウスでは心臓の硬化がどの程度抑制されるかを示す。メカノストレスによる心筋細胞の硬化を評価する。adhesion-GPCR X欠損マウスから単離した心筋細胞をシリコン膜ストレッチチャンバー上で培養し、一軸性進展刺激を加えた時の心筋細胞の反応（アクチン線維の配向の変化、ミオシン軽鎖のリン酸化）を定量することで心筋細胞の硬さを評価する。
α-kinase Xの基質同定のため、遺伝子欠損マウスから心筋細胞を単離し、細胞溶解液をリン酸化カラムに添加し、リン酸化されたペプチドを収集する。収集したサンプルを質量分析法により解析し、α-kinase Xによりリン酸化される物質およびリン酸化部位を決定し、心筋細胞の拡張メカニズムを検討する。
血栓形成における12-リポキシゲナーゼの局在・活性制御メカニズムの解明
Grant number：19K08853 2019.4 - 2023.3
科学研究費助成事業 基盤研究(C)
勝見 章, 天野 睦紀
Authorship：Coinvestigator(s)
血小板におけるアゴニスト受容体からのシグナルは Gα13を介して低分子量GTPase RhoAを活性化する。その結果血小板の形態変化、濃染顆粒 内容物の分泌をおこす。我々はアフィニティクロマトグラフィーにより活性化RhoA がフォルミンDaam1を介して12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)に結合することを見いだした。 12-LOXは主に血小板に発現し、アラキドン酸からの12-ヒドロキシエイコサテトラエン酸 (12-HETE)等の脂質メディエーター合成を介して血小板凝集を惹起する。本研究では活性化RhoA-Daam1が、12-LOXの細胞膜への局在を誘導し活性を制御することを証明する。
アラキドン酸リポキシゲナーゼ(ALOX)とその下流の脂質メディエーターは動脈硬化、血小板凝集、慢性炎症、がんの進展などに関与する多機能蛋白である。ALOX下流の脂質メディエーターについては活発に研究が行われているが、上流の制御メカニズムについては殆ど報告がなされていない。当該研究ではALOXの細胞内局在をRho family GTPaseが制御しており、動脈硬化部位、免疫器官など多様な臓器に脂質メディエーターをリクルートする際に Rho-ALOX経路が重要であるという仮説を証明するために蛋白生化学、マススペクトロメトリー、加齢マウスモデル等を用いた実験を計画した。我々はRhoA, Rac1,Cdc42などに加え、RhoH, Rac2等の血球特異的GTPaseをbaitにした網羅的アフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー(LC/MS-MS)の実験系を確立し、GTP結合型の活性型活性型RhoAに特異的に結合する複数の蛋白を同定した。そのうちアラキドン酸リポキシゲナーゼ-12(ALOX12)が活性型RhoAに結合することを見いだした。RhoAとALOX12をCOS-1細胞内で発現したところ両者の直接の結合は認められなかった。一方でRhoAエフェクターforminとALOX12の結合が発現実験で証明された。このことからALOX12はforminを介して活性型RhoAに結合することが強く示唆された。GTPase阻害剤による実験により、ALOXとの活性化依存性の結合が明らかになったRho family分子を同定した。GTPase阻害剤を内因性のALOXが発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)の産生抑制を定量する実験系を確立した。
本研究ではRhoファミリーGTPaseをbaitにした網羅的アフィニティクロマトグラフィーとそれに続くマススペクトロメトリー(LC/MS-MS)の実験系を確立し、血小板細胞質分画からGTP結合型の活性型活性型RhoAに特異的に結合する複数の蛋白を同定した。そのうちアラキドン酸リポキシゲナーゼ-12(ALOX12)が活性型RhoAに結合することを見いだした。RhoAとALOX12の直接の結合は認められなかったが、RhoAエフェクターforminとALOX12の結合がCOS-1細胞での発現実験で証明され、ALOX12はforminを介して活性型RhoAに結合することが判明した。GTPase阻害剤による実験により、ALOXとの活性化依存性の結合が明らかになったRho family分子を同定した。GTPase阻害剤を内因性のALOXが発現した細胞に添加し、脂質メディエーター(ロイコトリエン、リポキシン、HETEなど)産生抑制を測定する系を既に確立している。以上のことから研究計画は概ね順調に進展していると考えられる。
１）巨核球細胞株MEG-O1、CMK－86にL63RhoA(活性型)とN19RhoA(不活性型)を発現し、培養上清中の12-HETE産生がL63RhoAにより亢進することを確認する。さらに活性型RhoAによる12-HETE産生亢進がRhoA、forminの阻害薬であるC3 toxin、SMIFH2により抑制されるが、Rho-kinase阻害剤Y-27632では抑制されないことを証明する。
２）GST-forminを洗浄血小板に混和しcytoplasmicアクチン重合アッセイとpyreneラベル精製アクチンアッセイの双方でアクチン重合の定量を行い、12-LOX阻害剤ML355によりformin上でのアクチン重合が阻害されるかどうか検討する。これにより12-LOXがforminを介したアクチン重合を制御していることを証明する。また、ML355の添加による血小板のアクチン形態変化をRhodamine Phalloidin染色で観察する。
３）RhoA欠失マウスから分離した血小板の、アゴニスト刺激時の12-LOXの局在、12-HETE分泌量をそれぞれ免疫染色、ELISAで測定し、野生型マウス血小板と比較する。
Analysis of substrate recognition and regulatory mechanisms for protein kinases.
Grant number：17K07383 2017.4 - 2021.3
Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Amano Mutsuki
Authorship：Principal investigator
Grant amount：\4940000 （ Direct Cost: \3800000 、 Indirect Cost：\1140000 ）
In this study, we analyzed substrate recognition and regulatory mechanisms of protein kinases, as well as physiological and pathological functions. We identified the specific sequences of MYPT1, a substrate for Rho-kinase, as docking motifs (DMs) conferring selectivity and efficiency of phosphorylation by Rho-kinase. We also found that longer intrinsically disordered regions (IDRs) are preferably phosphorylated by stochastic simulation model using our screening dataset for 15 protein kinases. In addition, functional analyses revealed that MAPK-Npas4/MKL2 (mouse striatal neurons) and PKN-MKL1 (mouse heart) signals are involved in dopamine-induced gene expression and stress-induced cardiac dysfunction, respectively.
Study on regulatory mechanism of neural activity and emotional behavior by intracellular signals
Grant number：17H01380 2017.4 - 2021.3
Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
Kaibuchi Kozo
Authorship：Coinvestigator(s)
In this study, we comprehensively identified proteins that are phosphorylated downstream of neuromodulators (dopamine, adenosine, acetylcholine) and glutamate using our proprietary phospho-proteomics method. We have elucidated the intracellular signal transduction that regulates neuronal excitatory, synaptic plasticity, and gene expression at the molecular level, and also elucidated the regulatory mechanism of emotional behavior and its learning & memory.
The role of protein kinase N in cardiomyocyte
Grant number：17K09571 2017.4 - 2020.3
TAKEFUJI MIKITO
Authorship：Coinvestigator(s)
Heart failure is a complex syndrome that results from structural or functional impairment of ventricular filling or blood ejection. Protein phosphorylation is a major and essential intracellular mechanism that mediates various cellular processes in cardiomyocytes in response to extracellular and intracellular signals. We demonstrated that RHOA activates 2 members of the PKN family of proteins, PKN1 and PKN2, in cardiomyocytes of mice with cardiac dysfunction. Cardiomyocyte-specific deletion of the genes encoding Pkn1 and Pkn2 protected mice from pressure overload induced cardiac dysfunction. Furthermore, we identified MRTFA as a novel substrate of PKN1 and PKN2 and found that MRTFA phosphorylation by PKN was considerably more effective than that by ROCK in vitro. Our results indicate that PKN1 and PKN2 activation causes cardiac dysfunction and is involved in the transition to heart failure, thus providing unique targets for therapeutic intervention for heart failure.
Analysis of genes that affect individuality
Grant number：16H06528 2016.6 - 2021.3
Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Hoshino MIkio
Authorship：Coinvestigator(s)
To understand the genetic factors that govern individuality, this study investigated the genetic factors behind male (masculine) and female (feminine) behavior, as well as those behind good social interaction. First, we found that the transcription factor Ptf1a is expressed in the hypothalamus during mouse embryonic development and functions in the normal differentiation of the brain into male and female brains by give the brain "sex-differentiation competence”. We also revealed that the AUTS2 gene, which is associated with autism spectrum disorders in humans, regulates the excitatory/inhibitory balance in the brain by limiting the number of excitatory synapses, and that the breakage of the gene causes diverse changes in social behavior in mice. This study provides clues to the genetic factors of individuality.
The role of cellular localization of ALOX proteins in vascular aging
Grant number：15K09451 2015.4 - 2019.3
KATSUMI Akira
Authorship：Coinvestigator(s)
Rho family proteins play a role in organelle development, cytoskeletal dynamics, cell movement, and other common cellular functions.To identify novel downstream effectors of RhoA, we performed GST-RhoA affinity column chromatography by using platelet lysates. Cytosol fraction of platelet was loaded onto affinity columns on which GST, GST-RhoA-N19, or GST-RhoA-L63 was immobilized. Using triple quadrupole liquid chromatography tandem mass spectrometer, several proteins associated with active RhoA were identified. Arachidonate lipoxygenase (ALOX) binds to GST-RhoA-L63, but not to GST-RhoA-N19 along with the known RhoA effectors. ALOX does not directly bind to RhoA-L63, although Daam1 is shown to bind to ALOX. The second LH2 domain of ALOX directly binds to N-terminal of Daam1, suggesting that Daam1 functions as a scaffolding protein for the assembly of ALOX. We further investigate the roles of Daam1 on ALOX activity and subcellular localization of these molecules.
低分子量G蛋白質Rhoシグナルが関わる疾患の分子基盤の解明
2011.4 - 2013.3
科学研究費補助金 基盤研究(C)
天野睦紀
Authorship：Principal investigator
細胞増殖・分化に関わる蛋白質リン酸化酵素の新規基質スクリーニング法の開発
2008
科学研究費補助金 特定領域研究，課題番号：20058012
天野 睦紀
Authorship：Principal investigator
Ｒｈｏファミリーシグナル伝達系分子を対象とした疾患関連遺伝子の探索と解析
2008
科学研究費補助金 基盤研究(C)，課題番号：20590308
天野 睦紀
Authorship：Principal investigator
生体と薬物
2020
生物学基礎II
2020
生体と薬物
2019
生物学基礎II
2019
生体と薬物
2018
生物学基礎II
2018
生物学基礎II
2017
生体と薬物
2017
生物学基礎II
2016
生体と薬物
2016
生物学基礎II
2015
生物学基礎II
2014
生体と薬物
2014
生物学基礎II
2013
生体と薬物
2013
生物学基礎II
2012
生体と薬物
2012
生物学基礎II
2011
生体と薬物
2011
生体と薬物
2010
生体と薬物
2009
生体と薬物
2008
生体と薬物
015
