担当区分：研究代表者 

配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）

乳癌術後の乳房再建術に用いられるシリコンブレストインプラント（以下SBI）には、表面が凹凸のテクスチャード型SBIと、表面滑らかなスムース型SBIがある。テクスチャード型SBIはブレストインプラント関連未分化大細胞性リンパ腫の発症リスクがあり、一方でスムース型SBIは被膜拘縮や破損のリスクがある。本研究ではSBIを機能性ペプチドで加工して、それぞれの問題を予防できるSBIの新規開発を目指している。
乳房再建用エキスパンダーまたはSBIから周囲被膜組織を採取し、コラゲナーゼを用いて酵素処理後に抽出した細胞群から、蛍光活性化セルソーティング(FACS)でlineageマーカーいずれも陰性かつPDGFRA陽性の細胞群を線維芽細胞として分画し、この細胞群から、筋線維芽細胞へ分化していないCD248low線維芽細胞のみを単離し、培養中に筋線維芽細胞へ分化しないよう、ROCK阻害剤(Y-27632)を添加しながら継代培養して線維芽細胞を作成した。
この線維芽細胞について、細胞接着ペプチドとして知られている RGD配列をDOPAを用いて修飾し（以下RGD pep）、シリコン材料への接着と線維芽細胞の増殖性を調査した。細胞非接着性wellプレートにRGD pepコーティングによりコラーゲンコーティングと同様の線維芽細胞接着性、増殖性を確認後した。さらに凹凸面シリコンシェル及び平滑面シリコンシェルにRGD pep、コラーゲンでコーティングを行い、コーティングなしのシリコンシェルをコントールとして平滑面及び凹凸面シリコンシェル上での線維芽細胞の接着性と増殖を調査した。３条件共に平滑面より凹凸面の方が線維芽細胞の接着性を認めたが、平滑面RGD pepコーティングが他の条件の平滑面よりも高い細胞接着性を認めた。また他の平滑面シリコンシェルの条件に比べ、高い細胞増殖性を確認された。
これらの結果を踏まえ、動物実験を行い、テクスチャード型インプラントに見立てた凹凸面シリコンシェル片をPBS、Collagen、Collagen + Tyrosinase、RGDpepで修飾し、ラット背部肉様膜下にそれぞれのを挿入4週後のインプラントの移動と回転を評価し、RGD pep修飾群で最も少ない傾向を得た。
またこれらのインプラント挿入部に形成された被膜組織について組織学的な解析を行った。
シリコン表面をコーティングする機能性ペプチドの選択とそれによる、凹凸面・平滑面それぞれのシリコン表面への修飾、またシリコン上での線維芽細胞の接着及び増殖を確認する実験系ができた。最も細胞接着性が強い凹凸面シリコンシェルにRGD pep及び比較郡としてコラーゲンによるコーティングを行い、ラットの背部筋層下に移植してその移動と回転を評価した。４週間時点においてRGD pep修飾群で位置移動や回転が少ない傾向を得た。
またラットにおいて挿入したシリコン周囲に発生した被膜組織を得られるため組織学的検討を行ったが、今後サンプル数を増やし実験の再現性を確認の上で移植するシリコンの条件や留置期間を変えて調査を進めているが、これと並行して、医療用インプラントへのペプチド修飾方法を検討しているが、現在のコーティング方法であると立体的なインプラントへの修飾が難しいという難点が生じている。
動物数を増やすとともに、シリコンシェルを平滑面にして同様に各種コーティングを行って同様に追跡し、シリコンシェル片の移動性や回転性をさらに調査する予定である。
またシリコンシェル挿入後に生成された被膜を摘出して組織学的評価を行ったが、今後サンプル数を増やし実験の再現性を確認し、移植するシリコンの条件や留置期間を変えて調査を進めていく。
これと並行して、医療用インプラントへのペプチド修飾を前提とした方法を検証を進めていく。

担当区分：研究分担者 

本研究の目的は神経線維腫症1型(NF-1)の創傷治癒から瘢痕抑制のメカニズムを解明し、scarless wound healingを可能とする新規治療薬を開発することである。NF-1では手術後の瘢痕が目立ちにくく、肥厚性瘢痕やケロイドを生じにくいことが経験的に知られているが、NF-1の創傷治癒過程における過剰な瘢痕形成を抑制するメカニズムは明らかではない。現在行われている瘢痕治療の効果は限定的であり、手術や外傷後に傷あとが残ることは不可避であったが、NF-1に特有な創傷治癒メカニズムを再現することで、scarless wound healingの実現を試みる。
本研究の目的は、NF-1における創傷治癒と瘢痕抑制のメカニズムを解明し、scarless wound healingを実現する新規治療薬を開発することである。
昨年度までの実験では、正常な皮膚線維芽細胞に対するTGFβ-1の刺激によって筋線維芽細胞マーカーであるαSMA・TAGLNやⅠ型コラーゲンを構成するCOL1A2の発現上昇が確認された。しかし、NF-1患者由来の線維芽細胞では長期継代培養が安定して成功しなかったため当初の計画通りに研究を遂行することが困難であった。
そこで、過剰な瘢痕を形成するケロイドの原因となる分子メカニズムを解明することが、scarless wound healingにも応用可能であると考え、研究の焦点をケロイドに変更した。
まず、ケロイドおよび未熟瘢痕に対して免疫組織化学的染色を行い、筋線維芽細胞の分布を調べた。次に、ケロイドおよび未熟瘢痕の組織中で筋線維芽細胞が豊富な領域からトランスクリプトーム解析を行い、発現変動遺伝子を同定した。ケロイド特異的遺伝子として同定されたKANK4を線維芽細胞に過剰発現させ、細胞遊走アッセイを実施したところ、線維芽細胞の移動が促進された。
これらの実験結果から、ケロイド組織では、高い移動能を示すKANK4陽性の筋線維芽細胞が元の創傷を越えて移動することでケロイド病変の拡大に寄与していると考えられた。KANK4はケロイド治療の新規ターゲットであると同時に、scarless wound healingの治療標的となる可能性が示唆された。
当初予定していた研究計画に変更があったものの、その後の進捗は順調といえる。
モデル動物の創傷内で筋線維芽細胞の分化抑制実験を行い、scarless wound healingに有用であるかどうかを検証する。

担当区分：研究分担者 

遠隔部に生きたまま組織を移植する技術である遊離皮弁移植術において重要なことは1～3mmという非常に細い血管を吻合することにある。吻合そのものに加え、術後の血管の開存の判断にも熟練を要し、難渋することが少なくない。本研究の目的は、血管吻合後の血流の波形を、近年注目されている技術である深層学習を利用して解析を行い、開存度の判定を行うモニタリングシステムを開発することである。これにより、血管閉塞の早期発見および閉塞傾向の解析を行うことで開存度そのものの向上を目指す。

担当区分：研究分担者 

ケロイドや肥厚性瘢痕は、拘縮・疼痛や醜状など患者の負担は大きく、また治療難渋する症例も少なくなく、新たな治療法の開発が期待されている。近年、大気圧プラズマ研究の進歩により、細胞増殖・分化などに対する様々な影響が報告され始めた。その中で、筋線維芽細胞への分化やその増殖を、大気圧プラズマが制御できないか、という着想に至った。本研究では、①大気圧プラズマのラジカル分布パターン解析、②大気圧プラズマの皮膚創傷治癒関連細胞に与える影響の解析、③ケロイド・肥厚性瘢痕動物モデルで、大気圧プラズマによる発症・進展予防や治療の効果検討を行い、大気圧プラズマによるケロイド・肥厚性瘢痕に与える影響について検討する。
昨年までと同様、細胞レベルでのプラズマ活性化乳酸リンゲル液の肥厚性瘢痕・ケロイドに対する影響を調べるため、ケロイド・肥厚性瘢痕組織において重要な挙動を示す線維芽細胞に引き続き焦点を当てた。市販のヒト正常真皮由来およびケロイド由来線維芽細胞の比較では、両細胞とも処理用のプラズマ活性化乳酸リンゲル液を希釈するに従い増殖が亢進し、1/32倍以下の濃度では一定となる結果を得ていた。Covid-19の影響が重なる期間でもあり、現状得られたサンプルでは、両群間に統計劇的有意差は認めるには至っていない。もう少し多くのドナーで検証が必要と考えている。
昨年度までに難渋していたケロイド・肥厚性瘢痕動物モデルの作成をに関しては、本年度もさまざまなモデルを試行錯誤したが、正常皮膚ですら3ヶ月正着を維持する事ができなかった。そのため、ケロイド・肥厚性瘢痕の移植はできない状態である。
プラズマ活性化乳酸リンゲル液の生体に与える影響を検討するため、複数の倍率で希釈したプラズマ活性化乳酸リンゲル液を正常皮膚へ塗布し、解析を行った。皮膚所見では、原液から1000倍希釈液まで発赤やびらんなどの皮膚障害を認めなかった。塗布部の皮膚HE染色標本においても、マクロの所見と同様に炎症性細胞浸潤を認めなかった。また、各マウスの脾蔵・肝臓・腎臓を採取し、HE染色標本を作製したところ、各濃度での異常所見を認めなかった。さらに各マウスの採血を行い、血清を分離してサンプルを冷凍保存した。研究チームの医ミーティングで、プラズマ活性化リンゲル液暴露による反応として、酸化ストレスプロファイルの変化を解析すべきとの意見がでてきた。
本研究で最も重要な正常線維芽細胞とケロイド・肥厚性由来線維芽細胞（または筋線維芽細胞）間で、プラズマ活性化乳酸リンゲル液暴露による細胞増殖の有意差が出ていない。また、プラズマ活性化乳酸リンゲル液暴露を行う動物モデルの作成では壁に当たっているため。
プラズマ活性化乳酸リンゲル液暴露の条件として、濃度だけでなく、暴露時間に関しても複数の条件で試行を行い、条件の至適化を行う。
動物モデルに関しては、今まで通り難渋する事が予想されるが、諸家らの報告をさらに施行する予定である。

担当区分：研究分担者 

ケロイドは外的刺激などにより組織の繊維が増殖性に反応し、異常瘢痕を形成するもので、疼痛・掻痒・瘢痕拘縮といった症状に悩まされる。罹患者は国内で年間10万人といわれている。ケロイドは周囲の組織へ進展し、切除しても再発を繰り返すため難治であり、現在の治療はステロイドの外用や局所注射、切除と放射線治療などが行われているが、これらは基本的には対症療法であり、その原因の解明および病因に沿った治療が望まれている。本研究では、ケロイドにおけるエピジェネティクス機構の一端を解明し、エピジェネティクス治療薬によるケロイドの治療が可能であるかを検証することを目的とする。
本研究では、ケロイドにおけるエピジェネティクス機構の一端を解明し、エピジェネティクス治療薬によるケロイドの治療が可能であるかを検証することを目的とする。初年度、２年度ではケロイド特異的な遺伝子のスクリーニング及び同定を行った。その後ケロイド特異的な発現変動遺伝子に対し定量PCRを行い、Gene1（仮称）のケロイド組織中でmRNA発現量上昇を確認した。また、免疫染色においてもGene1タンパクは正常瘢痕よりもケロイド組織中で高く発現していた。組み換えプラスミドを用いたGene1強制発現HEK293T細胞は細胞移動能が低下し、さらにsiRNAを用いてGene1発現を阻害すると細胞移動能は回復した。
今回の研究でケロイド特異的に発現する遺伝子(Gene1）が同定され、in vitro　で細胞の移動能に関係する遺伝子であることが確認できた。今回の知見は２つの点で学術的及び社会的意義があると考えられる。
1. 詳細が完全に解明されていないケロイドの病態と細胞移動能の関係性が示唆された。今後この部分に着目した研究を行うことで病態解明に貢献できる可能性がある。
2. 今回ケロイド特異的遺伝子(Gene1）の特定及びその働きについて知見が得られた。この遺伝子を用いた治療につながる可能性がある。