科研費 - 榊原 均
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植物病原菌が作り出す新奇サイトカイニンの構造および生合成経路と機能の解明
研究課題/研究課題番号：19H00931 2019年4月 - 2023年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(A)
榊原 均, 小嶋美紀子, 西川 俊夫
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：45240000円 （ 直接経費：34800000円 、 間接経費：10440000円 ）
植物に感染し奇形を引き起こす帯化病菌Rhodococcus fasciansの病症原因遺伝子座FASオペロン遺伝子群の機能を解明し、この病原菌が生産する新奇サイトカイニン様分子の構造と生合成機構を、生化学、分子遺伝学、有機化学、分析化学的手法を駆使して同定する。また、この分子の宿主植物体内での作用機作を分子レベルで解き明かし、サイトカイニンの側鎖構造の多様性による「質的な作用調節機構のしくみ」を解明する。
研究分担者の西川により有機合成されたNC289の種々の類縁構造体と、in vitroで合成・構造を決定したNC289Rについて、NMR解析及び質量分析のフラグメント比較解析を行い、NC289Rの構造を完全に決定することに成功した。
次に、R. fasciansをタバコに感染させ、経時的にサイトカイニン分析を行なった。その結果、感染依存的にMe-iP, NC273が検出されたものの、NC289Rについては極微量であったため、質量分析のフラグメント解析で同一性を結論づけるには至らなかった。
年度途中よりR. fasciansが植物防疫所の許可の下、研究代表者の実験室での使用が可能になったため、菌の入手と培養条件の検討を行なった。その結果、植物由来の培地を使用することにより、FASオペロン遺伝子の発現量が、既報の培養条件の約100倍に増加する条件を見出すことに成功した。この方法により、in vitroでの合成で構造を決定していたNC245, NC273, NC289Rと、R. fasciansがin vivoで生産する新奇サイトカイニンの構造の同一性の結論づけに成功した。
一方、質量分析において、in vitro合成では見られない、m/z290の構造未知のピークも検出された。
構造決定された分子種について、サイトカイニン活性の評価を行ったところ、ARR遺伝子の誘導実験、酵母を用いたサイトカイニン受容体への親和性検討実験いずれにおいても、NC245, NC273, NC289Rと側鎖修飾が進むにつれて、サイトカイニンの活性は弱くなることが明らかになった。
当初の計画通り、R. fasciansが作り出す新奇サイトカイニンの構造を決定することができた。また、研究代表者の実験室でR. fasciansの使用が可能になったことが研究を加速させ、FASオペロンの発現を100倍程度増加させる培養条件を見出せたことは特筆すべき成果である。
構造の決定が終わった新奇サイトカイニンについて、その生理作用の検討を行う。新奇構造のサイトカイニンは、サイトカイニンとしての活性は弱いことが判明したが、これはR. fascians感染によるleafy gall形成とは一見矛盾するため、今後はこれら化合物を用いてグリーンカルス誘導実験やシュート再生誘導実験などのバイオアッセイを行い、分子活性を評価する。 -
研究課題/研究課題番号：17H06473 2017年6月 - 2022年3月
科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
榊原 均, 芦苅 基行
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：130780000円 （ 直接経費：100600000円 、 間接経費：30180000円 ）
植物シュート成長を支える茎頂幹細胞の機能維持に必須の役割を果たすサイトカイニンの生合成・代謝と輸送システム制御の成り立ちを、分子レベル、遺伝子レベルで解析し、維管束系を介して根から地上部へ輸送されるサイトカイニン分子種のうち、前駆体型輸送が茎頂幹細胞の機能維持に重要な役割を持ち、サイトカイニン活性化にはたらくLOGを介して作用すること、活性型輸送は主に葉面積など分化後の形質の制御に関わることを明らかにした。窒素栄養条件に応答したサイトカイニン生合成系遺伝子の発現制御研究の知見と統合し、栄養環境に応答した植物成長調節における、茎頂幹細胞へのサイトカイニン作用の分子機構モデルを構築した。
本研究により、植物の陸上バイオマスの根源ともいえる茎頂幹細胞の機能維持と活性調節におけるサイトカイニンの作用機作の分子基盤、具体的には、茎頂幹細胞を含む微空間内へのサイトカイニンの輸送と、作用に至るまでの代謝と移動、受容の場の空間的配置の重要性を明らかにすることができた。本研究成果は、植物バイオマス生産や低インプット型作物生産の向上のための分子育種に向けた重要な知識基盤となる。 -
植物病原菌が生み出すサイトカイニンの構造多様性と作用機作の分子基盤解明
研究課題/研究課題番号：23H00324 2023年4月 - 2027年3月
科学研究費助成事業 基盤研究(A)
榊原 均, 小嶋 美紀子, 西川 俊夫
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：46930000円 （ 直接経費：36100000円 、 間接経費：10830000円 ）
植物ホルモンの１つであるサイトカイニンの作用は、濃度変化による「量的」な調節と側鎖構造の多様性による「質的」な調節により、その強さと制御形質が規定される。ある種の植物病原菌では、その病症原因遺伝子座にコードされる酵素群が特殊な側鎖修飾をもつサイトカイニン様分子群を生産し、それらが宿主植物の情報統御の恒常性を撹乱することで奇形を誘発する。そこで本研究では、植物病原菌が作り出す新奇サイトカイニン様分子群の構造とその生合成機構と作用機作を分子レベルで解き明かし、病原微生物由来のサイトカイニン側鎖構造の多様性と質的な作用調節機構の基盤原理を明らかにする。
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研究課題/研究課題番号：22KF0164 2023年3月 - 2024年3月
科学研究費助成事業 特別研究員奨励費
榊原 均, 榊原 均, HLUSKA TOMAS, HLUSKA TOMAS
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：2200000円 （ 直接経費：2200000円 ）
サイトカイニンは、植物成長の促進制御に関わる重要な植物ホルモンの１つである。本研究では、ごく最近同定された細胞外（アポプラスト）空間でサイトカイニンの活性化に関わるリボシダーゼ遺伝子（CKR）について、その酵素学的な特徴づけと、シロイヌナズナにおける変異株の解析などを通じて、アポプラスト空間におけるサイトカイニン活性化の生理学的な役割を明らかにする。
2021年度に確立したシロイヌナズナCKR遺伝子（At5g18860）のT-DNA挿入系統（２系統）をMGRL寒天培地上および土耕栽培で生育させ経時的に成長様式の観察を行った。その結果、野生型と比べ目視で確認できる大きな差異はなかった。このことは本研究グループが先行して行っているイネのCKR遺伝子（CPN1）の機能欠失型変異体の成長表現型と同様であった。また、この変異体および野生株に活性型サイトカイニン（トランスゼアチン）とリボシド型前駆体（トランスゼアチンリボシド）を投与した際のサイトカイニン誘導遺伝子マーカー遺伝子（A-タイプ レスポンスレギュレーター遺伝子）の発現誘導度合いを定量的に比較するための実験条件（処理濃度と処理時間）の検討を行った。さらにCKRの発現部位を調べるためにCKR遺伝子上流のプロモータ領域をレポーター遺伝子（GUS）に連結させたコンストラクトを作成した。
CKR酵素タンパク質の生化学的特徴づけについては、メチロトローフ酵母Pichia pastoris内で発現系をpPICZaプラスミドを用いて構築、エレクトロポレーション法で導入し形質転換体を得た。
CKR遺伝子機能欠失変異体の表現型解析のリソースを構築し基礎的データを習得できた。このリソースを用いることで最終年度に遺伝子機能の解析を十分に進めることができる。また、メチロトローフ酵母Pichia pastoris内での発現系も構築することができたことから生化学的な特徴づけも今後進むものと期待できる。
最終年度は、CKR遺伝子のT-DNA挿入系統を用いた表現型観察を、窒素栄養条件を変動させるなどのサイトカイニンリボシド型前駆体の濃度変動が予想される条件下での成長表現型観察を行う。また、植物体内のサイトカイニン内生量解析、ロゼット葉から採取したアポプラスト液中のサイトカイニン定量解析を行う。CKR酵素タンパク質の生化学的な特徴づけについては、メチロトローフ酵母Pichia pastorisでのCKR過剰発現系の構築が完成したことから、タンパク質発現と精製を行い基質特異性やKm値などの酵素学的パラメーターを明らかにする。これらの研究の進捗をみながら国際学会などでの成果発表を行う。 -
細胞壁局在型サイトカイニンリボシダーゼの生理学的役割の解明 国際共著
研究課題/研究課題番号：21F21765 2021年11月 - 2024年3月
科学研究費助成事業 特別研究員奨励費
榊原 均, HLUSKA TOMAS
担当区分：研究代表者 資金種別：競争的資金
配分額：2200000円 （ 直接経費：2200000円 ）
サイトカイニンは、植物成長の促進制御に関わる重要な植物ホルモンの１つである。本研究では、ごく最近同定された細胞外（アポプラスト）空間でサイトカイニンの活性化に関わるリボシダーゼ遺伝子（CKR）について、その酵素学的な特徴づけと、シロイヌナズナにおける変異株の解析などを通じて、アポプラスト空間におけるサイトカイニン活性化の生理学的な役割を明らかにする。
イネCKRのシロイヌナズナにおけるオルソログ遺伝子（At5g18860, NSH3）のT-DNA挿入系統をABRCから3系統入手し、種子を播種し生育中の葉組織からDNAを抽出し、特異的プライマーを用いてホモヘテロ検定を行った。その結果に基づきホモ系統を選抜し、さらに生育させることで種子を収穫した。また、過剰発現株の作出のために、CaMV35SプロモーターにNSH3遺伝子を連結した融合遺伝子コンストラクトを作成した。
シロイヌナズナに存在する相同遺伝子群（NSH1, NSH2）も含め、組換え酵素タンパク質の発現系を構築するために、発現系の検討を行った。その結果、先行研究と同様に大腸菌では可溶性タンパク質として解析可能な収量が得られなかったことから、メチロトローフ酵母Pichia pastorisを用いた検討を行うこととした。
今年度の目標であったAt5g18860（NSH3）のT-DNA挿入遺伝子破壊株を複数系統確立できた。また、組換え酵素タンパク質調製のための発現系の検討も、当初の予定通り進んだ。
シロイヌナズナNSH3遺伝子（At5g18860）のT-DNA挿入系統を用いた表現型解析を行う。具体的には、成長様式観察、サイトカイニン内生量解析、ロゼット葉から採取したアポプラスト液を用いたサイトカイニン濃度定量解析を行う。
また、サイトカイニン作用調節におけるこの遺伝子の重要性を検証する。CKRの過剰発現系統についても、系統の確立を待って上記の解析を進める。
CKR酵素タンパク質の生化学的特徴づけについては、引き続き発現系の選択や培養条件の検討を行う。 -
研究課題/研究課題番号：19H05462 2019年4月 - 2024年3月
科学研究費助成事業 特別推進研究
堀 勝, 梶山 広明, 伊藤 昌文, 片岡 洋祐, 松本 省吾, 豊國 伸哉, 古閑 一憲, 榊原 均, 吉川 史隆
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
プラズマによって誘起された生体活性物質の分子構造と物性を突き止め、各物質と生体との相互作用を解明することによって、超バイオ機能発現の本質を明らかにする。また、活性物質による細胞死、増殖、分化などの真核生物に普遍的な現象の分子機構を解明する。その成果を基盤にして、プラズマ医療、農業という未来産業を拓く羅針盤となる、学術基盤『プラズマ生命科学』を切り拓き、地球規模の課題である、難病治療や食糧不足などを解決するイノベーションを産み出す。
我々はNMRやLC-MS/MSの実験手法を用いて、プラズマ活性乳酸リンゲル液（PAL）の主成分として、酢酸、ギ酸、ピルビン酸、2,3-ジメチル酒石酸、グリオキシル酸を同定し、2,3-ジメチル酒石酸は正常細胞に対してがん細胞を選択的に殺傷することやグリオキシル酸はがん細胞に対しても正常細胞に対しても細胞毒性を示すことを見出したが、この成果が今年度Scientific Reports誌に公表された。また、細胞外フラックスアナライザーを用い、PALが解糖系などの細胞呼吸にダメージを与えることをまとめた論文も公表され、更に、低温プラズマによる出芽酵母のアルコール発酵能の増大が解糖能の増大によることを明らかにした論文も公表された。また、雰囲気ガス完全制御プラズマ活性溶液作製装置により作製されたPALに2-メチルアミノアルコールが生成されることを明らかにしその成果をまとめた論文も公表された。更に、豊國らとの共同研究により、PAL投与した中皮腫細胞のメタボローム解析とそのフォローアップ実験を通じて、初期は外因的なNOによりオートファジーが誘導されるが、後期にはiNOS遺伝子発現の上昇に伴い、シトルリン-NOサイクルを上昇し、リソゾーム内にNOが蓄積することによりフェロトーシスが誘導することが明らかになったが、この成果をまとめた論文がRedox Biology誌(IF=~12)に公表された。また、片岡らとの共同研究により、大脳皮質への低温プラズマ照射が神経細胞の再生を誘導するという驚くべき効果の発見がAPEXに公表された。また、米国やドイツのプラズマ医療を先導する研究者らと共著で、がん治療におけるプラズマ活性溶液に関するreview論文をCancers誌（IF=~6）に公表した。またプラズマ医療のロードマップに関する国際共著論文がIEEE TRPMS誌に公表された。
当初計画していた、プラズマ活性溶液内に生成されるプラズマ誘起活性物質の同定は順調に進められ、いくつかの論文公表に至った上に、更に様々なプラズマ誘起活性物質が同定されており、期待通りの成果が挙げられていると言える。また、これまで、プラズマ医療に関する論文はインパクトファクターが2～4程度の雑誌に公表されることが多かったが、インパクトファクターが10以上のRedox Biology誌に公表されたことは特筆すべき成果と言える。また、プラズマ医療における我々の研究のポテンシャルは国際的にも高く評価されており、特にプラズマ活性溶液の研究において世界を先導する成果を挙げ続けてきたことが評価され、Cancers誌に国際共著review論文を公表したり、IEEE TRPMSに国際共著でロードマップに関するreview論文を公表するに至った。以上の成果により、当初の計画以上に進展していると言える。
本プロジェクトでは、網羅的な遺伝子発現解析、シグナル伝達ネットワークの解析、メタボローム解析により、統一的な細胞内分子機構の解明を行うことを１つのゴールとしているが、今年度までにメタボローム解析とそのフォローアップ実験により新たな細胞内分子機構を提唱することに成功した。更に、網羅的な遺伝子発現解析（マイクロアレイ解析）を通じて、プラズマ活性溶液が細胞にもたらす新たな細胞内分子機構が示唆されている。今後、PAL処理した細胞のマイクロアレイ解析のフォローアップ実験を行うことにより、PALによる細胞内分子機構を次々と明らかにしたいと考えている。その過程で、PALが特異的に活性化するシグナル伝達ネットワークが同定されたり、PALによるがん細胞への細胞死誘導の機構が統一的に明らかになることが期待される。また、引き続きNMRやLC-MS/MSによるプラズマ活性溶液内の成分の同定も進め、岐阜薬科大学などとの連携によりプラズマファーマシーの学理を確立する。低温プラズマがイチゴやイネなどの植物個体に与える影響の分子機構の解明や低温プラズマが免疫系を活性化する機構の解明を進めることにより、個体レベルでの統一的な分子機構の解明も目指す。 -
研究課題/研究課題番号：17H06470 2017年6月 - 2022年3月
科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)
梅田 正明, 山口 信次郎, 豊岡 公徳, 榊原 均, 五島 剛太, 林 誠, 蓑田 亜希子, 鳥居 啓子, 佐竹 暁子, 経塚 淳子
担当区分：研究分担者 資金種別：競争的資金
本領域は、植物がもつ永続的かつ旺盛な生命力に幹細胞の視点から迫るべく、植物幹細胞の増殖性や多能性の理解を目指して研究を進めた。領域内の有機的連携を図ることを目的として、領域外の動物研究者も巻き込んだ活動など、領域研究の活性化に繋がる種々の取り組みを行った。また、その成果を国内外に発信するために、国際シンポジウムやホームページ、ニュースレターを活用した広報活動を行った。
国内の学会シンポジウム・ワークショップの企画、及び領域主催の国際シンポジウムの開催を通じて、領域研究の成果を国内外の研究者に広く発信できた。また、幹細胞研究会などを通じて動物研究者と交流する機会が増え、約70名の動物研究者との繋がりができた。これは今後発生生物学分野を開拓していく際に重要な基盤になると考えられる。さらに、若手研究者の海外相互派遣や様々なアウトリーチ活動を通じて、次世代の研究者育成にも貢献できた。 -
植物病原菌の生産する新奇サイトカイニン様物質の生合成経路の解明
2012年4月 - 2015年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者
科研費
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植物ホルモンを介した炭素・窒素栄養バランス情報の伝達システムの解明
2009年10月 - 2013年3月
科学研究費補助金 新学術領域研究（研究領域提案型） 計画研究
担当区分：研究代表者
科研費
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単子葉植物におけるシスゼアチンの代謝システムと生理機能の解明
2009年4月 - 2012年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者
科研費
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トランジットペプチドを要しない色素体へのタンパク質輸送機構の解明
2006年4月 - 2009年3月
科学研究費補助金 基盤研究(B)
担当区分：研究代表者
科研費
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植物ホルモンを介した窒素情報伝達におけるHis-Aspリン酸リレー系の役割
2000年10月 - 2005年3月
科学研究費補助金 特定領域研究(B) 計画研究
担当区分：研究代表者
科研費
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シロヘム生合成と無機窒素・無機硫黄同化系の機能発現機構の研究
1999年4月 - 2001年3月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者
科研費
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グルタミン合成酵素多重遺伝子族の機能分化とその生理的意義の研究
1996年4月 - 1998年3月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者
科研費
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高等植物の窒素および炭素同化系遺伝子間での発現制御におけるクロストーク機構の解析
1994年4月 - 1995年3月
科学研究費補助金 奨励研究(A)
担当区分：研究代表者
科研費