研究者詳細 - 北　将樹

科研費 - 北　将樹

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研究課題/研究課題番号：23H03823 2023年4月 - 2026年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業学術変革領域研究(B)

恒松雄太, 酒井隆一, 北将樹, 犬塚俊康

担当区分：研究分担者資金種別：競争的資金

天然有機化合物(天然物)は各々の生物種に備えられた特殊な代謝機構を介して生合成される物質である。化学構造的多様性が高く、歴史的には医薬品開発の探索源などとして利用されてきた。その一方、実環境に目を移すと、各生産生物がどのような意図で天然物産生を行っているのか?産生された物質の生態における生理的機能や役割は何か?といった根本的な問いについては理解が進んでいない。そこで本研究ではサンゴ-褐虫藻-細菌叢間の共生系に着目し、これら生物間において相互作用に働く鍵物質を同定する。「物質を介して生態系を俯瞰する」という新しい観点を基にした生物圏の生態情報と物質機能情報を紐付ける新たな研究手法を確立する。

食虫動物トガリネズミ由来の忌避物質に関する化学進化生態学研究

研究課題/研究課題番号：20K21270 2020年7月 - 2022年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的研究(萌芽)

北将樹, 森田真布, 大舘智志

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

配分額：6500000円（直接経費：5000000円、間接経費：1500000円）

トガリネズミは唾液に毒を持つ珍しい哺乳類であるが、その筋肉組織には昆虫忌避物質が含まれ、また臭腺には大型哺乳類を忌避させる匂い物質が含まれると示唆される。危険を察すると相手を忌避させる物質を放出する動物は多いが、個体の死後まで忌避作用が継続することは珍しい。そこで本研究ではトガリネズミ由来の被食、補食に関わる新奇生理活性物質を解明し、トガリネズミ科の適応進化における匂い物質の役割を理解することを目指す。本研究の進展は、環境負荷の少ない防虫剤や、鳥獣被害が深刻なイノシシ・クマ避け剤など、新規有用物質の創製につながると期待される。
トガリネズミは唾液に毒を持つ珍しい哺乳類であるが、その筋肉組織には昆虫忌避物質が、また臭腺には大型哺乳類を忌避させる匂い物質が含まれるとされる。本研究ではトガリネズミ由来の被食、補食に関わる新規機能性物質を発見し、適応進化における役割を理解することを目指した。唾液腺抽出物の酵素活性を評価し、カリクレイン・プラスミン・トロンビンなど血液凝固などに関わるセリンプロテアーゼ様の活性を確認した。また臭線に含まれる揮発性成分をGC-MS法などで解析し、麝香臭物質として知られる大環状ラクトンを同定した。今後、同定した化合物を合成して活性を確認し、その生理的な機能の解明を目指す予定である。
様々な捕食動物のいる過酷な環境にて、小型の哺乳類であるトガリネズミ類はどのように生き延び、独自に進化してきたのか、進化生態学の観点からも大変興味深い。また微量・不安定物質の解析技術が進展した今、世界に先駆けて野生動物の極微量の生理活性物質に挑戦することは高い意義がある。生態学、進化生物学など関連諸分野とも連携して化合物の機能を解明し、長期的には生態系の理解や保全につながる研究への展開が期待される。また本研究の進展により化学合成品と比較しても環境負荷の少ない防虫剤や、鳥獣被害が深刻なイノシシ・熊避け剤など新規有用物質の創製が期待される点で、社会的意義も高い。

哺乳動物毒における化学コミュニケーションの解明

研究課題/研究課題番号：20H04770 2020年4月 - 2022年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業新学術領域研究(研究領域提案型)

北将樹

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

配分額：4940000円（直接経費：3800000円、間接経費：1140000円）

本研究では希少な哺乳類由来の有毒物質の構造と機能を解明し，より高活性な神経毒アナログの創製を目指す．食虫動物トガリネズミの持つ麻痺性ペプチドなどの構造や機能を解明し，痛覚過敏や神経因性疼痛など，痛み伝達に関わる新規な作用機序を解明する．さらに異種の哺乳類がもつ類似物質と構造や機能を比較し、独自に進化してきた種がもつ有毒物質（＝化学コミュニケーション物質）の生物学・生態学的意義を探る．
動物由来の天然毒は，フグ毒テトロドトキシンなどユニークな構造や切れ味鋭い活性をもつものが多い。また加速進化により，有毒動物の生理活性ペプチドには構造・機能に多様性がみられる。これらの毒は生命科学の研究ツールや，新たな医農薬の開発にも重要である。本研究では食虫動物トガリネズミ由来の麻痺性ペプチドBPP類の二次構造を決定し，合成標品を用いて詳細な生物活性を解明し、痛覚過敏や神経因性疼痛など，本物質が引き起こす痛み伝達に関わる新規作用機序の理解を目指した。さらに，異種の哺乳類がもつ類似物質と構造や機能を比較し、独自に進化してきた種がもつ麻痺性神経毒(=化学コミュニケーション物質)の生物学・生態学的意義を探ることとした。
BPP2を2つのセグメントに分けてFmoc固相合成法で調製し、これらをNCL法で結合した。Cys残基の３種類の保護基の段階的な除去とS-S結合の形成により、全長53アミノ酸残基のBPP2の合成を達成したが、そのHPLC保持時間やUVスペクトルのパターンは天然品とは全く一致しなかった。これまでに構造決定したBPP類の一次配列が誤っている可能性を考慮して一次配列を再検討し、[Glu-Gly] の2残基が [Trp] の1残基であるなど、構造の訂正に至った。
次いで一次配列改訂後のBPP2を再度合成した。Cys残基の保護基を１種類にして、NCL法で得られた一本鎖ペプチドの3組のSS結合を一挙に形成した。この際、Cysteine/Cystineを酸化還元触媒に用いたリフォールディング条件を工夫し、天然品とHPLC保持時間が一致する合成品がほぼ単一で得られた。現在、合成品BPP2の部分還元および選択的ラベル化により、SS結合様式の解析を進めている。また、合成品BPP2を用いた各種イオンチャネルに対する応答評価、ミールワーム麻痺活性試験についても今後評価する予定である。
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

細胞夾雑系における生理活性蛍光リガンドを用いた標的分子の結合様式解析

研究課題/研究課題番号：20H04703 2020年4月 - 2022年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業新学術領域研究(研究領域提案型)

北将樹

担当区分：研究代表者資金種別：競争的資金

配分額：4940000円（直接経費：3800000円、間接経費：1140000円）

N,N-ジメチルアミノピレン(dmpy)基は，ラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法（LA-LDI MS）のために開発した蛍光タグであり、標的タンパク質の同定やリガンドの結合位置解析に有用である．本研究では，リガンド解離型および光親和性dmpyプローブを合成し，細胞夾雑系における標的分子の効率的なラベル化と細胞内局在解析を目指す．また新規なLA-LDI MSタグの開発や，様々な生体分子の効率的なラベル化法も検討する．
蛍光基ピレンを持つ化合物は、マトリックスを使用しないラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法(LA-LDI MS)で選択的に励起・検出される。これまでに、従来よりも約10万倍高感度でLA-LDI MS検出できるN,N-ジメチルアミノピレン(dmpy)基を開発した。また、ゲルろ過樹脂を用いてdmpyラベル化タンパク質およびペプチドを簡便に脱塩・精製して選択的にMSで検出できる。本研究では、リガンド解離型および光親和性dmpyプローブを合成し、細胞夾雑系における標的分子の効率的なラベル化と細胞内局在解析を行うことを目指した。
リガンド解離型dmpyプローブの設計と合成では、リガンドにベンゼンスルホン酸やビオチン、検出基にdmpy基を持つリガンド解離型プローブを合成した。反応性官能基にNASAを用いることで、標的タンパク質である炭酸脱水素酵素やアビジンの位置選択的なラベル化に成功した。さらに細胞内夾雑系のモデル反応として、培養細胞の抽出タンパク質を含む系で上記のプローブとの反応を検討し、アビジンの選択的なラベル化に成功した。
さらに、リガンド、反応性官能基(ジアジリン)、検出基(dmpyや(歪み)アルキン)を持つ光親和性プローブを合成し、精製タンパク質や細胞抽出液と混合してUV365の照射により共有結合を形成させる条件を検討した。365 nm 単波長レーザーを用いた紫外線装置により、10秒以下という短時間で水溶液やメタノール溶液中にてジアジリン基が効率的に反応し、溶媒との共有結合が反応することを見出した。今後は培養細胞におけるラベル化を検討し、dmpyラベル化産物の簡便な精製法を確立する。また分子モデリング計算(MOE)による結合様式の解析や、生細胞蛍光イメージングによるdmpy基の局在解析を行う予定である。
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

タンパク質間相互作用を誘導する有機小分子を用いた運動マシナリー研究

研究課題/研究課題番号：19H02839 2019年4月 - 2022年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B)

北将樹

担当区分：研究代表者

配分額：17550000円（直接経費：13500000円、間接経費：4050000円）

細胞骨格タンパク質アクチンに作用する天然物リガンドに注目して，創薬標的となる新たなPPI機能作用点の特定および関連する運動マシナリーの解明を目指す．細胞形態の観察や機能性分子プローブを用いたアフィニティー精製により，多様な天然物リガンドの第２の標的分子を同定し，三元複合体の構造や相互作用を解明する．プローブの細胞内動態やin vitro構築系でのダイナミクスへの影響を精査し，生物活性発現メカニズムを明らかにする．
本研究ではアクチンに作用する天然物リガンドに注目して、創薬標的となる新たなPPI機能作用点を特定し、細胞骨格が関連する運動マシナリーの解明を目指した。アクチンとチューブリン間のタンパク質間相互作用を誘導して微小管ダイナミクスを阻害する抗腫瘍性天然物アプリロニンA (ApA)を構造簡略化したアクチン結合性誘導体を合成し、細胞抽出液からアクチンを特異的に精製できる有用なツールを開発した。また、分子ドッキングシミュレーションと分子動力学計算により、ApAの活性発現に重要なC7位のTMSerエステルがチューブリンと相互作用する、アクチン-ApA-チューブリン三元複合体の妥当なモデルの構築に成功した。
PPIは生命現象を担うシグナル伝達系を調節し、重要な生理的効果を誘導する。近年，PPIを安定化もしくは阻害する化合物が多数見いだされ、疾患研究ツールや医薬リードとしても注目されている。本研究では動的で不安定な細胞骨格タンパク質を標的とする天然物に注目し、これまで未解明だった標的分子の同定、複合体の構造解析、および活性発現機構の解明に挑戦した点で学術的に高い意義があると考えられる。また、本研究で得られた成果は、副作用を低減した新たな医薬の創出や、複合的に機能する新たな薬理学ツールの開発といった学際的・分野融合的な研究へと展開できると期待されることから、社会的意義も高い成果と言える。

哺乳動物毒における化学コミュニケーションの解明

研究課題/研究課題番号：18H04613 2018年4月 - 2020年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業新学術領域研究(研究領域提案型)

北将樹

担当区分：研究代表者

配分額：5200000円（直接経費：4000000円、間接経費：1200000円）

動物由来の天然毒にはユニークな構造や切れ味鋭い活性をもつものが多い。また加速進化により、有毒動物由来の生理活性ペプチドには多様性がみられる。このような新規神経毒の化学的解明は、薬理学、神経科学、精神医学など広範な生命科学の発展に寄与し、疼痛治療薬など新規薬剤の開発にも直結する1)。本研究では、化学生態学・進化学的にも興味深い、哺乳類由来の有毒物質の構造・機能・生物学および生態学的意義を解明し、より高活性な神経毒アナログを創製することを目指して本研究を実施した。
(1) トガリネズミ由来の麻痺性神経毒 BPP 類の構造決定と合成・生物活性の解明：有毒哺乳類の一種トガリネズミ由来の新規麻痺性神経毒ペプチド２種を発見し、その一次構造とCaチャネルに対する開口活性を解明した。
(2) カモノハシ毒液由来の新規ペプチドの作用機序と新奇神経毒リガンドの創製：CNP断片ペプチドの新たな薬理活性として、GABA受容体の positive allosteric modulator 機能を発見した。
(3) 標的受容体・リガンド間の相互作用を質量分析法で解析する新手法の開発：標的分子との結合様式を解明する新たなツールとして、ラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法（LA-LDI MS）に適用できる新規アミドピレン誘導体を開発した。またビオチン・アビジン相互作用をモデルとした標的分子におけるリガンドの結合様式を高精細に解析できる新手法を提唱した。さらに従来よりも100倍以上高感度な LA-LDI MS 測定が可能なN,N-ジメチルアミノピレン基を創出した。
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

カリブ海地域の固有・希少野生生物の生態化学的調査

研究課題/研究課題番号：16H05655 2016年4月 - 2020年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B)

北将樹, 溝田浩二, 大舘智志, ラザロエチェニケディアズ

担当区分：研究代表者

配分額：13650000円（直接経費：10500000円、間接経費：3150000円）

本研究では絶滅危惧種の哺乳類キューバソレノドンや、民間伝承の薬用植物などカリブ海の固有・希少な野生生物に関する生態化学的調査を実施した。キューバ共和国およびドミニカ共和国で合計140日間のフィールド調査を行なったが、ソレノドンの捕獲には至らなかった。しかし、以前の調査で捕獲した個体のDNAサンプルを用いてキューバソレノドンの進化的位置付けを解明し、薬用植物Jacaranda sp. から単離したjacaranoneの抗炎症作用を新たに見出した。
カリブ海の亜熱帯・熱帯地域の島国は生物多様性が高く、野生生物の生態調査や保全は緊急の課題となっている。ソレノドンは、イスパニョーラ島およびキューバ島にしか生息しない絶滅危惧種の哺乳類であり、約7,500万年前に発生して独特の進化を遂げてきたとされるが、その生態や進化系統は長らく不明であった。今回の調査では新たな個体は捕獲できなかったが、餌昆虫や糞成分の分析などから、その生存を示す貴重な痕跡を確認することができた。またドミニカ共和国との共同研究体制を構築できたことは、今後のハイチソレノドンの国際共同研究を進める上でも重要と言える。

新規抗癌剤開発に向けた腫瘍血管新生・癌転移阻害ペプチドの創成

研究課題/研究課題番号：15H02503 2015年4月 - 2018年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(A)

金保安則, 藤井郁男, 北将樹, 船越裕司, 山内庸平, 三浦悠樹, 宮地泰人, 藤原大祐, 米田耕三, 山岸航大

担当区分：連携研究者

本研究では、Arf6をターゲットとした革新的抗癌剤開発のためのリードペプチドを創出することを目指し、次の結果を得た。Arf6に特異的なGTPase-activating proteinのARAP3はArf6の不活性化を介して浸潤仮足を制御すること、及びリンパ管内皮細胞のArf6は、腫瘍増殖を制御することを明らかにし、Arf6は腫瘍増殖と癌細胞浸潤・転移の両者を制御することが検証できた。そこで、約35アミノ酸残基からなるペプチドライブラリーを用いてArf6阻害ペプチドを探索した結果、Arf6を特異的に阻害する１つのペプチドを見出し、抗癌剤開発へと繋がる創薬リードペプチドの創出に成功した。

光親和性プローブとLA-LDI-MSを用いた標的生体分子の結合部位解析法の開発

2015年4月 - 2017年3月

科学研究費補助金挑戦的萌芽研究

北将樹

担当区分：研究代表者

光親和性プローブとLA-LDI-MSを用いた標的生体分子の結合部位解析法の開発

研究課題/研究課題番号：15K12753 2015年4月 - 2017年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的萌芽研究

北将樹

本研究では、ラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法（LA-LDI MS）を用いて、プローブと結合した断片ペプチドを選択的かつ高効率に検出できる光親和性プローブを創出し、新たな結合位置解析法を開発することを目指した。まず、LA-LDI MSおよびMS/MS解析に適用できる6-アミドピレン（apy）基を見出した。ついで光反応基（ジアジリン基）を持つ抗腫瘍性天然物アプリロニンAのapyプローブを合成し、これが溶媒分子と高効率で共有結合することを見出した。さらにNHS基を持つアプリロニンAのapyプローブを合成し、アクチンの定量的なラベル化とラベル化ペプチドの配列決定に成功した。

海洋天然物の誘導するタンパク質－タンパク質相互作用の解明

研究課題/研究課題番号：26242073 2014年6月 - 2019年3月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(A)

木越英夫, 大好孝幸, 北将樹

担当区分：研究分担者

海洋天然物であるアプリロニンＡは、二大細胞骨格タンパク質であるアクチンとチューブリンのタンパク質間相互作用を誘導するという新型の作用機序により前例のない強力な抗腫瘍性を示す。本研究では、そのタンパク質間相互作用誘導に必要な構造情報を明らかにするとともに、これらの情報に基づくアナログの開発を行った。その結果、アクチンと結合する側鎖部について、マクロラクトン部との連結部分の置換様式と立体化学が重要であることがわかった。この情報に基づいて、簡略化アナログを開発することができた。
タンパク質間相互作用は、生物活性発言に重要であることが知られている。天然物のような有機小分子が接着剤となって、通常は相互作用がない２種類のタンパク質をつなぎ合わせる例としては、免疫抑制ポリケチドであるFK506が知られているが、２大細胞骨格タンパク質であるアクチンとチューブリンを連結する有機小分子は知られておらず、アプリロニンＡは新しい機構による抗腫瘍性物質である。本研究により、アプリロニンＡにおけるタンパク質間相互作用を誘導する構造因子のいくつかが明らかになったことにより、新型の作用機序による抗がん剤開発のための基礎的知見が収集できた。

海洋天然物の誘導するタンパク質－タンパク質相互作用の解明

2014年6月 - 2017年3月

科学研究費補助金基盤研究(A)

木越英夫

担当区分：研究分担者

細胞骨格タンパク質の関わる抗腫瘍性発現機構の解明

2014年4月 - 2016年3月

科学研究費補助金新学術領域研究

木越英夫

陸棲哺乳類の産生する麻痺性神経毒およびプロテアーゼの構造と機能

2013年4月 - 2016年3月

科学研究費補助金若手研究(A)